李家明，林志強(qiáng)，黃則棟，陳露，許茹，鐘鳳林，*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002；2.福建省種子管理總站，福建福州350000；3.福建田美種業(yè)科技股份有限公司，福建福州350000）

苦瓜（Momordica charantia L.）是葫蘆科苦瓜屬一年生草本植物，主要以食用嫩瓜為主，口感清爽帶苦味，老熟苦瓜清香而味甜，是一種重要的藥食兼用園藝作物。苦瓜果實(shí)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要包括維生素、礦物質(zhì)元素、氨基酸、類黃酮以及皂苷等生物活性物質(zhì)[1-3]，具有清熱去火、明目利尿、降血糖、抗癌等藥用功效[4-5]。我國(guó)苦瓜品種繁多，通常依據(jù)傳統(tǒng)植物學(xué)性狀來(lái)進(jìn)行分類，如苦瓜果實(shí)的形狀、果皮的顏色、果實(shí)表面瘤狀突起等，按果實(shí)顏色可分為：白色、白綠色、黃綠色、淺綠色、綠色、深綠色、墨綠色[6]。相關(guān)研究表明，不同果色的果實(shí)在口感、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量上存在差異，果實(shí)顏色與果實(shí)的品質(zhì)和風(fēng)味存在一定的相關(guān)性[7-9]。隨著消費(fèi)者對(duì)苦瓜需求的不斷增加，苦瓜果實(shí)除了鮮食之外，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種苦瓜的加工產(chǎn)品，如苦瓜茶[10]、苦瓜發(fā)酵酒[11]、苦瓜果脯[12]、苦瓜飲料[13]等，探究不同果色苦瓜果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的差異，有助于苦瓜加工產(chǎn)品的研發(fā)，拓寬苦瓜消費(fèi)市場(chǎng)。

單萜類化合物具有揮發(fā)性，是一類重要的揮發(fā)性物質(zhì)，其感官閾值低，具有濃郁的香味，對(duì)果實(shí)的香氣起著重要的貢獻(xiàn)作用。目前，在葡萄[14]、柑橘[15]、番茄[16]、甜椒[17]等果實(shí)中均有相關(guān)研究。苦瓜果實(shí)具有獨(dú)特的香氣，苦瓜特有的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)苦瓜果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)及苦瓜果實(shí)副產(chǎn)品加工方面有著重要作用。楊敏[18]的研究結(jié)果表明甘肅主產(chǎn)的苦瓜果實(shí)主要揮發(fā)性成分為醛類和醇類，不同的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)苦瓜果實(shí)香氣貢獻(xiàn)不同。關(guān)于苦瓜果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)成分尚有待進(jìn)一步研究，本試驗(yàn)選取不同果實(shí)顏色的苦瓜果實(shí)，采用頂空固相微萃?。╤ead space solid-phase micro-extractions，HE-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，探究不同果色苦瓜果實(shí)之間單萜類物質(zhì)成分組成及其含量的差異，并進(jìn)行主成分分析和聚類分析，從而為苦瓜果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的研究利用、風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)以及苦瓜果實(shí)的深加工提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材及儀器

試驗(yàn)材料于2018 年10 月17 日采摘于福建田美種業(yè)科技股份有限公司白沙育種基地，均選取授粉后15 d 的苦瓜果實(shí)，白色苦瓜（K1）、白綠色苦瓜（K2）、黃綠色苦瓜（K3）、淺綠色苦瓜（K4）、綠色苦瓜（K5）果實(shí)各采摘3 份作為重復(fù)。

SPME 手動(dòng)進(jìn)樣器、DVB/CAR/PDMS 萃取頭（50/30 μm）：美國(guó) Supelco 公司產(chǎn)品；Clarus SQ8T 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Perkin Elmer 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HS-SPME 取樣

樣品制備、頂空固相微萃取方法和氣相色譜質(zhì)譜條件在楊敏[18]的方法上有所改動(dòng)。取不同果色苦瓜果肉中段部分進(jìn)行勻漿，分別稱取5 g 勻漿置于20 mL樣品瓶中，加入1 g 氯化鈉分析純，密封后置于70 ℃恒溫磁力攪拌器上平衡10 min，樣品3 次重復(fù)。把固相微萃取頭置于氣相色譜進(jìn)樣口于250 ℃條件下老化2 h 后，插入頂空樣品瓶 1/3 處，70 ℃下吸附 30 min。

1.2.2 GC-MS 分析

將固相微萃取頭從樣品瓶中抽出，插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口處，于250 ℃下解析7 min。

色譜條件：檢測(cè)器溫度：250 ℃；進(jìn)樣器溫度：240 ℃；載氣：He2（純度99.999%）；柱流量：1 mL/min；分流比：15 ∶1；進(jìn)樣方式：無(wú)分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度 65 ℃，以 3 ℃/min 的速率升溫至 155 ℃，保持 0 min，以 10 ℃/min 的速率升至 230 ℃，保持 0 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度：240 ℃，離子源溫度：200 ℃，離子方式：EI；電子能量：70 ev；掃描質(zhì)量范圍：30 u～550 u。

1.2.3 定性及定量分析

通過(guò)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST 2011）檢索及結(jié)合保留指數(shù)對(duì)其進(jìn)行定性分析。果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的定量采用峰面積歸一化法計(jì)算出各成分的相對(duì)含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析

用Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；運(yùn)用SPSS 21.0 進(jìn)行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果色苦瓜果實(shí)中單萜類物質(zhì)數(shù)目比較

不同果色苦瓜果實(shí)單萜類物質(zhì)組成比較結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同果色苦瓜果實(shí)單萜類物質(zhì)組成比較Fig.1 Comparison of the composition of monoterpenoids in five different fruit color bitter gourd fruits

由圖1 可知，在綠色苦瓜（K5）果實(shí)中檢測(cè)到單萜類物質(zhì)成分最多，包括8 種單萜醇、5 種單萜醛、2 種單萜酮、3 種單萜烯、1 種單萜炔，共計(jì)19 種單萜類物質(zhì)。白色苦瓜（K1）果實(shí)中檢測(cè)到的單萜成分最少，包括8種單萜醇、2 種單萜醛、2 種單萜酮、1 中單萜烯，共計(jì)13 種單萜類物質(zhì)。白綠色苦瓜（K2）、黃綠色苦瓜（K3）和淺綠色苦瓜（K4）果實(shí)中分別檢測(cè)到 18、16、15 種單萜類物質(zhì)。在5 種不同果色苦瓜果實(shí)中，白綠色苦瓜（K2）果實(shí)中單萜醇的物質(zhì)種類最多，淺綠色苦瓜（K4）最少；綠色苦瓜（K5）果實(shí)中單萜醛種類最多，白色苦瓜（K1）最少。單萜炔類物質(zhì)僅在白綠色苦瓜（K2）、黃綠色苦瓜（K3）和綠色苦瓜（K5）果實(shí)中有檢測(cè)出，淺綠色苦瓜（K4）果實(shí)中單獨(dú)檢測(cè)到1 種單萜酯類物質(zhì)，白色苦瓜（K1）中未檢測(cè)到單萜酯和單萜炔類物質(zhì)。

2.2 不同果色苦瓜果實(shí)中單萜類物質(zhì)成分及含量的比較分析

通過(guò)對(duì)5 種不同果色苦瓜果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)鑒定及定量分析，共檢測(cè)出29 種單萜類物質(zhì)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

包括11 種單萜醇：順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、紫蘇醇、順式-馬鞭草烯醇、4-（1-甲基乙基）-1，4-環(huán)己二烯-1-甲醇、2-（4-亞甲基環(huán)己基）丙-2-烯-1-醇、L-紫蘇醇、順式-2，8-薄荷二烯-1-醇、芳樟醇、橙花醇、香葉醇；9 種單萜醛：異環(huán)檸檬醛、反，反-2，4-癸二烯醛、反式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、β-環(huán)檸檬醛、順式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、（2E）-（3，3-二甲基亞）乙醛、1α，2α，5α-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)戊烷甲醛、龍腦烯醛、香葉醛；4 種單萜烯：2，5，5-三甲基-庚 1，3ξ，6-三烯、4-甲基-1-（丙-1-烯-2-基）環(huán)己烯、α-氧化蒎烯、1，1-五亞甲基-1，2-戊二烯；3 種單萜酮：側(cè)柏酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮；1 種單萜酯：巴豆酸己烯酯。此外，還有1 種單萜炔類物質(zhì)：2-甲基-1-壬烯-3-炔。5 種不同果色苦瓜果實(shí)共同檢測(cè)出的單萜類物質(zhì)成分有7 種，包括：順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、順式-馬鞭草烯醇、橙花醇、香葉醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮。

表1 5 種不同果色苦瓜單萜類物質(zhì)成分及相對(duì)含量Table 1 Monoterpenoids and their relative contents in five different fruit colors of bitter gourd

續(xù)表1 5 種不同果色苦瓜單萜類物質(zhì)成分及相對(duì)含量Continue table 1 Monoterpenoids and their relative contents in five different fruit colors of bitter gourd

不同果色苦瓜果實(shí)中單萜類物質(zhì)總含量之間存在顯著差異：白綠色苦瓜（K2）＞黃綠色苦瓜（K3）＞白色苦瓜（K1）＞綠色苦瓜（K5）＞淺綠色苦瓜（K4）。對(duì)共有的7 種單萜類物質(zhì)成分含量比較發(fā)現(xiàn)：白綠色苦瓜（K2）的共有物質(zhì)成分含量最高，占總含量的70.702%，綠色苦瓜（K5）最低，占總含量的50.059%。其中，共有揮發(fā)性物質(zhì)成分桃金娘烯醇的含量為最高，含量均超過(guò)揮發(fā)物總含量的40%，白綠色苦瓜（K2）果實(shí)的桃金娘烯醇含量高達(dá)64.152%，而綠色苦瓜（K5）果實(shí)中的桃金娘烯醇含量相對(duì)較低，占揮發(fā)物總含量的41.332%，可推測(cè)桃金娘烯醇為5 種不同果色苦瓜果實(shí)中共有的香氣物質(zhì)。白綠色苦瓜（K2）果實(shí)中順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、順式-馬鞭草烯醇的釋放量顯著高于其他4種顏色的苦瓜；綠色苦瓜（K5）果實(shí)中橙花醇、香葉醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮的釋放量顯著高于其他4 種顏色苦瓜。對(duì)差異物質(zhì)進(jìn)行比較可知：白綠色苦瓜（K2）果實(shí)中檢出獨(dú)有的揮發(fā)性單萜類物質(zhì)成分為順式-2，8-薄荷二烯-1-醇；黃綠色苦瓜（K3）果實(shí)中檢出獨(dú)有的物質(zhì)為（2E）-（3，3-二甲基亞）乙醛；淺綠色苦瓜（K4）獨(dú)有的單物質(zhì)為異環(huán)檸檬醛、巴豆酸己烯酯；綠色苦瓜（K5）獨(dú)有的物質(zhì)為β-環(huán)檸檬醛、香葉醛。

2.3 不同果色苦瓜果實(shí)單萜類物質(zhì)的主成分分析

以單萜類物質(zhì)成分的相對(duì)含量數(shù)據(jù)為參數(shù)，對(duì)除桃金娘烯醇外的28 種單萜類揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同果色苦瓜單萜類物質(zhì)得分散點(diǎn)圖Fig.2 The dispersive point diagram of monoterpenoids in different fruit colors of bitter gourd

根據(jù)特征值大于1 原則，共提取2 個(gè)主成分，這2個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為83.073%，能夠反映原始數(shù)據(jù)的絕大部分信息，其中主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別解釋了57.569%和25.504%的變量信息。在PC1 中，C1 號(hào)順式—檜萜醇、C12 號(hào)β-環(huán)檸檬醛、C17 號(hào)香葉醛、C18 號(hào)側(cè)柏酮、C27 號(hào)香葉醇、C28 號(hào)α-紫羅蘭酮的載荷最高，對(duì)第一主成分貢獻(xiàn)率最大。在 PC2 中，C7 號(hào) L—紫蘇醇、C11 號(hào)反式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、C13 號(hào)順式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、C15 號(hào) 1α，2α，5α-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)戊烷甲醛、C29 號(hào)β-紫羅蘭酮對(duì)第二主成分貢獻(xiàn)率較大。

2.4 不同果色苦瓜果實(shí)聚類分析

對(duì)5 種不同果色苦瓜果實(shí)的單萜類物質(zhì)成分采用平方歐式距離類平均法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同果色苦瓜果實(shí)單萜類物質(zhì)成分的聚類圖Fig.3 Cluster analysis tree diagram of different fruit bitter gourd

在距離為10 時(shí)將5 種不同果色苦瓜分為2 組，其中白色苦瓜（K1）、黃綠色苦瓜（K3）和白綠色苦瓜（K2）聚為第Ⅰ組，淺綠色苦瓜（K4）和綠色苦瓜（K5）聚類為第Ⅱ組。聚類分析結(jié)果表明在白色苦瓜（K1）、黃綠色苦瓜（K3）和白綠色苦瓜（K2）果實(shí)中檢測(cè)到的單萜類物質(zhì)成分和含量上具有較高的相似性；淺綠色苦瓜（K4）和綠色苦瓜（K5）果實(shí)中的單萜類物質(zhì)在成分組成和含量上相似性較高。

3 結(jié)果與討論

目前，關(guān)于苦瓜揮發(fā)性物質(zhì)的研究主要集中在干燥方式對(duì)苦瓜茶的品質(zhì)及揮發(fā)性物質(zhì)的影響[19]，除此之外，在苦瓜種子[20-21]、葉片[22]揮發(fā)油等方面也有相關(guān)研究。本研究針對(duì)不同果色苦瓜果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)中的單萜類物質(zhì)成分進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)單萜類物質(zhì)在苦瓜果實(shí)揮發(fā)性物中占重要地位，單萜類物質(zhì)成分含量均超過(guò)苦瓜揮發(fā)性物質(zhì)總含量的55%，說(shuō)明苦瓜果實(shí)中的主要揮發(fā)性物質(zhì)為單萜類物質(zhì)，包括單萜醇、單萜醛、單萜酮、單萜烯烴類、單萜炔烴類及單萜酯。楊敏[18]和張小鳳[23]的研究結(jié)果表明，苦瓜果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)主要是醇類和醛類物質(zhì)，這兩類物質(zhì)為苦瓜果實(shí)香氣具有重要貢獻(xiàn)作用，本試驗(yàn)結(jié)果與其相符。但在苦瓜具體物質(zhì)成分和含量上有很大差異，可能是因?yàn)榭喙掀贩N、成熟度、種植地區(qū)和栽培模式等存在差異，造成揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量有較大差異。

單萜類物質(zhì)對(duì)果實(shí)的香氣以及風(fēng)味品質(zhì)有著重要的影響，其感官閾值低，香味濃郁，從不同程度上對(duì)果實(shí)風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用，在葡萄[24]、玫瑰[25]、茶葉[26]等植物中是重要的香氣物質(zhì)。除此之外，單萜類物質(zhì)在食品[26]、農(nóng)業(yè)[27]、醫(yī)藥[28]等方面有很廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)在5 種果色苦瓜果實(shí)中檢測(cè)到的單萜成分達(dá)29 種，其中單萜醇類物質(zhì)桃金娘烯醇的含量最高，含量均超過(guò)揮發(fā)物總含量的40%，白綠色苦瓜（K2）果實(shí)中桃金娘烯醇含量最高，占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的64.152%。桃金娘烯醇具有檀木香和薄荷清香，用途廣泛，可以用做香料、香精、合劑和修飾劑等[26]?？喙瞎麑?shí)揮發(fā)性物質(zhì)中桃金娘烯醇的相對(duì)含量最高，可以推測(cè)桃金娘烯醇為苦瓜果實(shí)的特征性香氣物質(zhì)，可為苦瓜果實(shí)提供濃郁的清香。5 種不同果色苦瓜共有單萜類物質(zhì)僅7 種，順式-檜萜醇、桃金娘烯醇、順式-馬鞭草烯醇、橙花醇、香葉醇、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮，共有成分含量均超過(guò)揮發(fā)物總含量的50%，構(gòu)成5 種不同果色苦瓜的主體風(fēng)味。不同果色苦瓜之間單萜類物質(zhì)成分差異較大，能夠提供不同果色苦瓜自身的特有香味，白綠色苦瓜（K2）特有的物質(zhì)為順式-2，8-薄荷二烯-1-醇；黃綠色苦瓜（K3）特有的物質(zhì)為（2E）-（3，3-二甲基亞）；淺綠色苦瓜（K4）特有的物質(zhì)為異環(huán)檸檬醛和巴豆酸己烯酯；綠色苦瓜（K5）特有的物質(zhì)為β-環(huán)檸檬醛和香葉醛。通過(guò)對(duì)不同果色苦瓜果實(shí)單萜類物質(zhì)的主成分分析，除桃金娘烯醇外對(duì)苦瓜果實(shí)香氣有重要貢獻(xiàn)的物質(zhì)為順式—檜萜醇、β-環(huán)檸檬醛、香葉醛、側(cè)柏酮、C 香葉醇、α-紫羅蘭酮、L—紫蘇醇、反式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、順式-4，5-二環(huán)氧（E）-2-癸烯醛、1α，2α，5α-2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）環(huán)戊烷甲醛、β-紫羅蘭酮，這些物質(zhì)雖然相對(duì)含量不高，但由于其香氣閾值低，也能夠從不同程度上對(duì)苦瓜果實(shí)的香氣做出貢獻(xiàn)。

顏色相近的苦瓜果實(shí)之間存在共有的單萜物質(zhì)成分：白色苦瓜（K1）和白綠色苦瓜（K2）果實(shí)中檢測(cè)出的共有單萜類物質(zhì)是龍腦烯醛和芳樟醇；白綠色苦瓜（K2）和黃綠色苦瓜（K3）共同檢測(cè)出含量相對(duì)較高的側(cè)柏酮；黃綠色苦瓜（K3）和淺綠色苦瓜（K4）果實(shí)中共存的物質(zhì)為紫蘇醇，淺綠色苦瓜（K4）和綠色苦瓜（K5）果實(shí)中共有物質(zhì)為 2，5，5-三甲基-庚 1，3ξ，6-三烯，表明果實(shí)顏色相近的苦瓜在揮發(fā)性單萜類物質(zhì)成分組成上具有共性。聚類分析將5 種不同果色苦瓜分為兩類，第一類苦瓜果實(shí)顏色為白色、白綠色、黃綠色，顏色整體偏淺，單萜類物質(zhì)相對(duì)含量較高，超過(guò)63%，這3 種果色苦瓜果實(shí)單萜類成分及含量最為相似，可分為一類。第二類苦瓜果實(shí)顏色綠色偏深，但單萜類物質(zhì)總含量相對(duì)較低，占揮發(fā)物總含量的55%左右，這兩種果色苦瓜果實(shí)在單萜成分的組成及含量上具有一定的相似性，可分為第二類。觀察苦瓜果實(shí)顏色變化與揮發(fā)物總含量之間的關(guān)系可發(fā)現(xiàn)：苦瓜果實(shí)的顏色深淺與單萜類物質(zhì)的組成和相對(duì)含量具有一定的相關(guān)性，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步證明。