葛柯樂，方成，燕海嬌，袁青玲，陳文玉，王琦，吳駿

蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院，江蘇常州 213003

胃癌是一種異質(zhì)性、多因素的疾病，是常見的惡性腫瘤之一。早期胃癌癥狀不典型，大多數(shù)患者確診時(shí)已是胃癌晚期，預(yù)后差，病死率高[1]。因此，迫切需要探尋出新的診斷方法和準(zhǔn)確評估患者預(yù)后的標(biāo)志物，這對臨床研究及患者的治療具有重要的指導(dǎo)意義。2001年，驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員精子相關(guān)抗原5(SPAG5)被首次發(fā)現(xiàn)，其也稱為有絲分裂紡錘體相關(guān)蛋白5[2,3]。SPAG5作為紡錘體結(jié)合蛋白之一，在有絲分裂S期通過C-未端序列結(jié)合于紡錘體，在細(xì)胞周期M期表達(dá)升高，調(diào)控有絲分裂中紡錘體的裝配時(shí)間及姐妹染色體分離，主要表達(dá)于精原細(xì)胞，在胃、腸、肝臟等正常組織中低表達(dá)[4～7]。SPAG5表達(dá)的高低與細(xì)胞的增殖狀態(tài)密切相關(guān)，下調(diào)細(xì)胞的SPAG5蛋白表達(dá)，將形成多級(jí)異常紡錘體，致使分裂停止[8,9]。已有相關(guān)研究[10～12]表明，SPAG5具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，SPAG5參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在宮頸癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌及膀胱癌中SPAG5表達(dá)量增加，且其過表達(dá)與患者不利的預(yù)后相關(guān)[10,12～14]。提示SPAG5可能是參與癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要致癌基因，可視為潛在的治療靶點(diǎn)。SPAG5在胃癌中的作用尚不清楚，本項(xiàng)研究旨在檢測SPAG5在胃癌組織中的表達(dá)變化，同時(shí)分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，明確SPAG5在胃癌患者中預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集2015年9月～2017年3月在常州市第一人民醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的41例患者的臨床資料。其中，男30例、女11例，年齡30～73歲、中位年齡61歲。所有病例為經(jīng)手術(shù)治療的初診患者，術(shù)后經(jīng)2名以上病理學(xué)專家確診，并按照WHO胃癌組織學(xué)分類和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行胃癌分期的判定。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后切除標(biāo)本經(jīng)病理診斷證實(shí)為胃癌；②臨床病例資料完整，隨訪數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)腫瘤；②合并其他影響胃癌預(yù)后的疾病或因素。術(shù)后標(biāo)本取出后部分保存于液氮中，部分用10%多聚甲醛固定并包埋在石蠟中。

同時(shí)，從上海芯超生物有限公司購買胃癌組織芯片(HStm-A180Su-11)。芯片中包含180例芯點(diǎn)(90例癌組織和與之匹配的90例癌旁組織)。組織來源患者中男61例、女29例，中位年齡65.5歲。所有患者術(shù)前均未接受放射或化學(xué)等其他治療，芯片中所有組織經(jīng)病理專家讀片確診為胃癌。胃癌TNM分期采用美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期系統(tǒng)(2010年第七版)。

1.2 SPAG5 mRNA檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR。利用TRIzol試劑(Invitrogen)提取組織樣本中的總RNA，紫外分光光度儀測定260、280 nm吸光度值，計(jì)算RNA含量。根據(jù)PrimeScriptTMRT(Clontech Laboratories)試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用ABI Prism 7900HT熒光定量PCR儀檢測(Applied Biosystems)，以ABL1作為內(nèi)參，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)做3次。SPAG5和ABL1基因的引物及TaqMan探針采用美國ABI公司商品(Hs00197708_m1和Hs00245445_m1)。RT-PCR體系為：TaqMan?Gene Expression Master Mix(2×) 10 μL，引物及TaqMan探針1 μL，cDNA 2 μL(相當(dāng)于100 mg RNA)，加雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min預(yù)變性，95 ℃ 10 min熱啟動(dòng)，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 60 s退火延伸，40個(gè)循環(huán)，60 ℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)。將SPAG5基因已知陽性模板從10～1×103倍比稀釋，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線斜率為-0.301 9，相關(guān)系數(shù)為0.9966。PCR擴(kuò)增效率106%，提示該P(yáng)CR反應(yīng)體系及引物均正常。ABL1內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及條件同SPAG5基因，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔCt進(jìn)行相對定量分析。

1.3 SPAG5蛋白檢測 采用免疫組化法。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照鏈霉菌親和素—過氧化物酶法(SP)兩步法進(jìn)行。SPAG5抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。常規(guī)脫蠟、水化,3% H2O2室溫孵育15 min,枸櫞酸鹽緩沖液微波抗原修復(fù),加入多克隆兔抗人SPAG5抗體(稀釋比1∶1 000)置于室溫下2 h，使用Envisionfi過氧化物酶試劑盒(Dako)檢測抗原抗體反應(yīng)。然后將組織在室溫下用0.05% 3,3-二氨基聯(lián)苯胺(Dako)中孵育30 s，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色后請兩位中級(jí)職稱以上病理醫(yī)生采用半定量H-score評分法對組織標(biāo)本進(jìn)行評分，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)高倍視野(200倍)，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，以染色強(qiáng)度和該強(qiáng)度下細(xì)胞的百分比乘積定為標(biāo)本染色評分[15]。染色強(qiáng)度從陰性至強(qiáng)陽性分別計(jì)為1、2、3分；陽性細(xì)胞率0計(jì)0分，≤10%計(jì)1分，>10%～50%計(jì)2分，>50%～80%計(jì)3分，>80%計(jì)4分；總分為0～12，將0～6定為低表達(dá)、8～12為高表達(dá)。

1.4 隨訪 患者術(shù)后隨訪采用電話或門診復(fù)查形式，末次隨訪時(shí)間為2019年05月01日?？偵嫫?OS)為從病理確診日期到死亡日期或末次隨訪時(shí)間；無疾病生存期(DFS)為從病理確診日期到疾病復(fù)發(fā)或死亡時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件包和Graphpad Prism 8.0.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及繪圖。首先對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，偏態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)(四分?jǐn)?shù))[M(P25,P75)]表示。根據(jù)Cutoff Finder網(wǎng)站獲取SPAG5 mRNA評估預(yù)后的截?cái)嘀礫16]。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較胃癌組織和癌旁組織SPAG5表達(dá)的差異；采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)比較SPAG5表達(dá)與患者臨床病理特征的差異；采用Kaplan-Meier方法建立生存曲線，Log-Rank檢驗(yàn)方法比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPAG5 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 SPAG5 mRNA在所有胃癌組織中均表達(dá)，中位相對表達(dá)量為0.300(0.145,0.683)。從Cutoff Finder網(wǎng)站獲SPAG5 mRNA的最佳截?cái)嘀禐?.184，并根據(jù)截?cái)嘀捣譃楦弑磉_(dá)者30例和低表達(dá)者11例。SPAG5 mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。

表1 41例胃癌組織中SPAG5 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2 SPAG5蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的相關(guān)性 41例胃癌患者中，SPAG5蛋白高表達(dá)率75.6%(31/41)，低表達(dá)率24.4%(10/41)；胃癌組織中SPAG5蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系見表2。在胃癌組織芯片研究中，有4例癌組織實(shí)驗(yàn)過程中脫落，剩余86例有效樣本進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)胃癌組織SPAG5蛋白表達(dá)高于癌旁組織(胃癌組織和癌旁組織的H-score評分中位值分別為8和4)，P<0.01；SPAG5蛋白高表達(dá)率69.8%(60/86)，低表達(dá)率30.2%(26/86)；SPAG5蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系見表3。

表2 41例胃癌組織中SPAG5蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

注：本表格中理論頻數(shù)均小于5，采用Fisher確切概率檢驗(yàn)。

2.3 SPAG5表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 41例胃癌患者均獲取隨訪，中位DFS和OS分別為28(11.5～35.0)、33(18.5～36.0)個(gè)月。芯片組織中胃癌患者隨訪時(shí)間為88個(gè)月，中位OS為24.0(8.0～84.3)個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析顯示，在41例胃癌組織中，SPAG5 mRNA高表達(dá)者無病生存率和總生存率分別為46.67%、53.33%，低表達(dá)者分別為54.55%、81.82%，兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SPAG5蛋白高表達(dá)者無病生存率和總生存率分別為48.39%、58.06%，低表達(dá)者分別為50.00%、70.00%，兩者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在胃癌芯片組織中，SPAG5蛋白高表達(dá)者總生存率(31.67%)與低表達(dá)者(42.31%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

胃癌已成為癌癥死亡的最常見病因之一，根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2018年全球最新癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，因癌癥死亡的病例中，胃癌占8.2%，居第2位[17]。盡管胃癌診療技術(shù)不斷完善，但是胃癌5年生存率仍很低[18]，因此迫切需要胃癌早期診斷和評估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。大量研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與過表達(dá)一些致癌基因密切相關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤中可檢測位于染色體Ch17q11.2上SPAG5基因的過表達(dá)且其參與體內(nèi)不同的分子生物學(xué)過程包括細(xì)胞增殖和凋亡[19,20]。2016年Abdel-Fatah等報(bào)告在10%～19%乳腺癌中存在Ch17q11.2基因位點(diǎn)擴(kuò)增，且SPAG5基因拷貝畸變數(shù)與患者不利的臨床預(yù)后及不良的臨床病理特征相關(guān)，包括TP53突變、PAM50-LumB表型和PAM50-HER2表型等[19]。更進(jìn)一步研究顯示，SPAG5高表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān)。SPAG5高表達(dá)患者對含蒽環(huán)類藥物的新輔助化療更敏感，患者生存期更長，其原因可能是SPAG5擴(kuò)增導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和紡錘體著絲點(diǎn)松弛，提高蒽環(huán)類藥物干擾有絲分裂，從而提高抗腫瘤作用，故SPAG5是乳腺癌患者蒽環(huán)類新輔助化療方案的獨(dú)立預(yù)測因子之一[19,21]。下調(diào)宮頸癌中SPAG5的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，有絲分裂G2/M期受阻，細(xì)胞增殖受抑，從而阻止癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖[12]。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)SPAG5可通過上調(diào)Wnt3來激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡。在肝癌研究中，SPAG5通過β-catenin/TCF4信號(hào)通路下調(diào)SCARA5的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[11]。綜上可見，SPAG5目前多被認(rèn)為發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用，可視為新的生物標(biāo)志物。

表3 胃癌組織芯片中SPAG5蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

為探索SPAG5與胃癌的關(guān)系，對41例胃癌患者研究發(fā)現(xiàn)，SPAG5 mRNA表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性，SPAG5蛋白表達(dá)僅與患者的性別相關(guān)，女性患者高表達(dá)比例高于男性。生存分析發(fā)現(xiàn)，SPAG5表達(dá)與患者DFS及OS均無明顯相關(guān)性?？紤]前期研究樣本量偏少，且缺少癌旁組織進(jìn)行對照，為進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)，獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們檢測了商品化的胃癌組織芯片中SPAG5的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織SPAG5表達(dá)高于癌旁組織，但SPAG5蛋白表達(dá)高低與患者臨床病理因素及OS均無顯著相關(guān)性。雖然芯片組織中SPAG5蛋白表達(dá)高低與性別無明顯相關(guān)性，但女性患者高表達(dá)比例高于男性，因此，SPAG5與性別的關(guān)系需進(jìn)一步研究。采用UALCAN網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌患者SPAG5 mRNA表達(dá)與OS的關(guān)系，同樣發(fā)現(xiàn)SPAG5基因表達(dá)與OS無相關(guān)(P=0.79)，結(jié)果與本課題一致，提示SPAG5在胃癌中無預(yù)后判斷價(jià)值。但是，Liu等[22]最近報(bào)道SPAG5高表達(dá)與胃癌患者不利預(yù)后顯著相關(guān)，且高表達(dá)與腫瘤直徑≥5 cm和晚分期明顯相關(guān)，女性患者高表達(dá)比例高于男性(66% vs. 58%)，但差異不顯著，進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，SPAG5通過上調(diào)Survivin蛋白，激活wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。雖然本研究的結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫一致，但是與Liu等實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，這可能與特定的人群及樣本量相關(guān)。此外，實(shí)驗(yàn)材料和過程以及結(jié)果判讀與本研究也不盡相同。

本項(xiàng)研究仍然存在一些不足之處，該研究為回顧性研究，樣本量偏少，關(guān)于患者信息及疾病特征的收集納入會(huì)存在不可控的偏倚，且患者術(shù)后治療方式不能詳細(xì)獲得。此外，該研究納入的臨床數(shù)據(jù)有限，因此SPAG5與胃癌患者其他的臨床病理特征的相關(guān)性無法分析。由于SPAG5與患者預(yù)后無顯著相關(guān)性，所以未進(jìn)一步擬合COX回歸分析。因此，需要從不同醫(yī)院收集更多的胃癌標(biāo)本來證實(shí)SPAG5與胃癌的關(guān)系。SPAG5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

綜上所述，胃癌組織中SPAG5表達(dá)高于癌旁組織，SPAG5表達(dá)高低可能與患者性別有關(guān)，SPAG5不具有評估胃癌患者預(yù)后作用，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本來驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。