曾保征，王贛，陳超，黃遠(yuǎn)麗，董超

1麻城市人民醫(yī)院，湖北麻城 438300；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種常見的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率，患者的5年生存率低于12%[1]。HCC的發(fā)生與酒精性肝硬化、病毒性肝炎等有關(guān)，其發(fā)生、發(fā)展及遷移、侵襲與基因、蛋白、細(xì)胞因子等許多因素有關(guān)。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的小分子短鏈非編碼RNA，廣泛參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)過程。近期國內(nèi)外研究表明，miR-613在宮頸癌[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但目前國內(nèi)外有關(guān)miR-613在HCC中表達(dá)變化的研究甚少，并且作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究觀察了HCC組織中miR-613的表達(dá)情況，并探討了miR-613過表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2018年6月在麻城市人民醫(yī)院治療的60例HCC患者，所有患者診斷均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，手術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療等治療。選取手術(shù)切除腫瘤組織為HCC組織，同時(shí)選取離腫瘤組織邊緣5 cm以外的癌旁組織作為對(duì)照。60例患者中男44例、女16例，年齡(56.75±12.86)歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)肝癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)HCC患者進(jìn)行臨床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期41例。根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)[7]對(duì)患者進(jìn)行病理分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ～Ⅲ級(jí)19例，Ⅳ級(jí)22例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人HCC細(xì)胞系MHCC97H、SMMC-7721和人正常肝細(xì)胞系L02購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在溫度為37 ℃、5% CO2、飽和濕度的情況下進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.3 miR-613檢測(cè) 采用miRNA分離純化試劑盒(美國Ambion公司)提取肝癌組織、癌旁組織標(biāo)本及細(xì)胞的總miRNA，采用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)對(duì)總miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。取cDNA，按照TaqMan miRNA檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)miR-613的表達(dá)水平。引物由美國GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)合成。引物序列如下：miR-613引物上游為5′-ACACTCCAGCTGGGATGGAATGTTCCTTC-3′,下游為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGAAACGG-3′；U6引物上游為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件為10 min 95 ℃，10 s 95 ℃，20 s 60 ℃，15 s 72 ℃，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-613的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞分為miR-613 mimics組和mimics-NC組，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)分別將購自上海吉瑪制藥公司的miR-613模擬物(miR-613 mimics)或模擬物陰性對(duì)照(mimics-NC)轉(zhuǎn)入各組SMMC-7721細(xì)胞，6 h換1次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)24～48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-613的表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.5 細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT實(shí)驗(yàn)。將miR-613 mimics組、mimics-NC組細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染成功后24、48、72 h每孔加入10 μL的MTT溶液(美國Sigma公司)培養(yǎng)4 h，再加入100 μL的溶解液，直至紫色結(jié)晶溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定492 nm處的光密度(OD)值。以O(shè)D值表示細(xì)胞的增殖活性。

1.6 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。離心收集miR-613 mimics組、mimics-NC組轉(zhuǎn)染成功48 h后的細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞使細(xì)胞懸液濃度為1×109/L。按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)說明書操作，取細(xì)胞懸液0.5 mL，加入1.25 μL的Annexin V-FITC在室溫下進(jìn)行15 min的避光反應(yīng)，離心收集細(xì)胞，采用預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液0.5 mL輕輕重懸，加入10 μL的碘化丙啶避光保存于冰上，采用CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.7 細(xì)胞侵襲及遷移情況觀察 采用Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。在Transwell小室接種前，將Matrigel(美國BD公司)預(yù)鋪小室上室。在上室接種200 μL濃度為2×105/mL的無血清培養(yǎng)基細(xì)胞，下室加入600 μL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色后將上層細(xì)胞擦掉并用PBS洗滌。在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)并取平均值，即為侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，不用Matrigel預(yù)鋪小室上室，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-613在HCC組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-613在HCC組織的表達(dá)為0.32±0.11，較癌旁組織(0.98±0.04)表達(dá)降低(t=43.678，P<0.05)。以miR-613表達(dá)的均值為截?cái)帱c(diǎn)，分為高表達(dá)(23例)和低表達(dá)(37例)。miR-613表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。

2.2 miR-613在人肝細(xì)胞系中的表達(dá) miR-613在人HCC細(xì)胞系MHCC97H和SMMC-7721的相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.13、0.21±0.09，均較人正常肝細(xì)胞系L02(1.05±0.11)表達(dá)降低(t=5.391、10.237，P均<0.05)。選擇miR-613表達(dá)最低的SMMC-7721細(xì)胞作為后續(xù)研究對(duì)象。

2.3 miR-613對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖活性的影響 轉(zhuǎn)染后，miR-613 mimics組miR-613相對(duì)表達(dá)量為5.47±0.34，較mimics-NC組(0.99±0.06)升高(t=22.475，P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染效率較高。miR-613對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響見表2。

表1 miR-613表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

表2 miR-613對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

注：與mimics-NC組相比，*P<0.05。

2.4 miR-613對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 miR-613 mimics組細(xì)胞凋亡率為(26.48±4.14)%，較mimics-NC組[(5.98±1.75)%]升高(t=7.900，P<0.05)。

2.5 miR-613對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移及侵襲的影響 miR-613 mimics組、mimics-NC組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(160±22)、(342±34)個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(105±19)、(279±23)個(gè)，兩組相比P均<0.05。

3 討論

HCC早期癥狀較為隱匿，70%～80%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，診斷后患者的平均生存時(shí)間為6個(gè)月，沒有治療的患者5年生存率小于3%[8]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HCC的病死率有所下降，但HCC的復(fù)發(fā)率較高，患者預(yù)后仍然很差。隨著蛋白質(zhì)組和基因組學(xué)研究的發(fā)展，近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA在不同腫瘤中表達(dá)模式不同，并且與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為惡性腫瘤的靶向治療提供了新的思路。

miR-613是一種近期發(fā)現(xiàn)的存在人體內(nèi)的miRNA家族成員之一，其定位于人染色體12p13.1，含有20個(gè)核苷酸。miR-613在多種腫瘤組織或細(xì)胞中呈低表達(dá)，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。李傳芬等[9]研究表明miR-613在膠質(zhì)瘤組織中呈低表達(dá)，且miR-613可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。張東兵等[10]的研究表明，上調(diào)miR-613可抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖和遷移及侵襲。Yu等[11]研究表明miR-613在膀胱癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲。上述文獻(xiàn)研究表明，miR-613在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著抑癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-613在HCC組織的表達(dá)明顯低于癌旁組織，在人肝癌細(xì)胞系中表達(dá)低于正常肝細(xì)胞系，與上述其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析表明,TNM分期越晚，miR-613表達(dá)越低；Edmondson分級(jí)越高，miR-613表達(dá)越低，提示miR-613與HCC的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，對(duì)HCC的分期和病理分級(jí)具有潛在的預(yù)測(cè)價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的miRNA水平可以有效抑制惡性腫瘤的發(fā)展，因此可能成為一種有效的分子靶向治療方式。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-613后SMMC-7721細(xì)胞增殖活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)中穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)均明顯減少，結(jié)果表明過表達(dá)miR-613能夠抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)研究表明，在腎細(xì)胞癌中，miR-613通過靶向CTTN而調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移[12]。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中，miR-613通過靶向調(diào)節(jié)雙皮質(zhì)素激酶樣結(jié)構(gòu)域1而致使細(xì)胞周期停滯。Wu等[14]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中miR-613通過靶向血管內(nèi)皮生長因子A而抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。miR-613在HCC中作用的具體下游靶基因，尚需在進(jìn)一步的研究中預(yù)測(cè)并驗(yàn)證。

綜上所述，miR-613在HCC中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-613能夠抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為HCC的靶向治療提供了新的方向。