莊妍，謝小缺，章超

1 安徽省第二人民醫(yī)院，合肥230000；2 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽部黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，全世界每年鼻咽癌新發(fā)病例約8萬例，死亡達5萬例[1]。我國鼻咽癌的發(fā)病率和病死率均高于世界平均水平。根據(jù)全國腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，2014年新發(fā)鼻咽癌病例約4.5萬例、死亡約2.4萬例[2]。由于鼻咽癌病灶較為隱匿，早期臨床癥狀無特異性，多數(shù)患者就診時已進展至中晚期，放射治療效果較差且易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。因此，深入研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找鼻咽癌早期診斷、個體化治療和預(yù)后評估的腫瘤標志物具有重要意義。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)是一種胞質(zhì)酪氨酸激酶，廣泛參與細胞因子受體超家族成員的信號傳遞。JAK2是JAK家族成員之一，其基因定位于染色體9p24.1，編碼的蛋白具有非受體蛋白酪氨酸激酶活性，能夠參與IL-6、IFN-γ等細胞因子受體信號傳導(dǎo)途徑的信號傳導(dǎo)。有研究表明，乳腺癌組織中存在JAK2信號傳導(dǎo)途徑過度激活現(xiàn)象，通過激活下游的信號通路，促進靶基因表達，如趨化因子2(CCL-2)；而CCL-2能夠招募腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞，從而發(fā)揮免疫抑制作用[3]。有研究報道，JAK2信號傳導(dǎo)途徑過度激活可能與鼻咽癌患者預(yù)后不良有關(guān)[4]，提示JAK2可能參與鼻咽癌的惡性進展。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物，其基因定位于染色體17q21.2，編碼的蛋白主要通過受體酪氨酸激酶磷酸化后活化，以二聚體形式發(fā)揮核內(nèi)靶基因表達調(diào)控作用。研究表明，活化的STAT3能夠激活下游細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等基因表達，促進肝癌、鼻咽癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。本研究觀察了鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達變化，并探討其表達與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年2月～2016年2月安徽省第二人民醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的鼻咽癌患者85例。所有患者經(jīng)鼻內(nèi)鏡下活檢或術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合鼻咽癌診斷；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③一般狀況良好，Karmofsky評分≥70分；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者；②合并其他部位惡性腫瘤或嚴重感染性疾病者；③入院前接受任何抗腫瘤治療者；④近期有外傷或手術(shù)史者；⑤臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男50例，女35例；年齡18～74(48.1±7.2)歲，≤60歲41例、>60歲44例；有吸煙史28例，無吸煙史57例；組織分化程度：高分化23例，中分化29例，低分化33例；TNM分期[6]：Ⅰ、Ⅱ期61例，Ⅲ、Ⅳ期24例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。本研究經(jīng)安徽省第二人民醫(yī)院和安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 JAK2、STAT3 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取鼻咽癌組織和癌旁正常組織各50～100 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop2000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：JAK2上游引物5′-TCTGGGGAGTATGTTGCAGAA-3′，下游引物5′-AGACATGGTTGGGTGGATACC-3′；STAT3上游引物5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′；GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物3′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-5′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR?Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，去離子水3.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 鼻咽癌患者出院后以門診或電話等形式定期隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪截至2019年2月，統(tǒng)計患者生存情況，計算3年總體生存率。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽癌組織與癌旁正常組織JAK2、STAT3 mRNA表達比較 鼻咽癌組織與癌旁正常組織JAK2 mRNA相對表達量分別為1.410±0.232、0.472±0.113，STAT3 mRNA相對表達量分別為0.945±0.137、0.427±0.101。鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA相對表達量均明顯高于癌旁正常組織(t分別為26.754、23.261，P均<0.01)。

2.2 鼻咽癌組織JAK2 mRNA表達與STAT3 mRNA表達的關(guān)系 Pearson線性相關(guān)分析顯示，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與STAT3 mRNA相對表達量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.622，P<0.01)。

2.3 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA相對表達量均與TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，而與性別、年齡、吸煙史、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 鼻咽癌組織JAK2、STAT3 mRNA表達與患者預(yù)后的關(guān)系 截至隨訪日期，共隨訪1～36個月，中位隨訪時間32個月。

以JAK2 mRNA相對表達量的均數(shù)1.410為臨界值，將鼻咽癌患者分為JAK2 mRNA高表達者43例、低表達者42例，其3年總體生存率分別為51.2%(21/43)、83.3%(35/42)，JAK2 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于JAK2 mRNA低表達者(χ2=3.874，P<0.05)。見圖1。

以STAT3 mRNA相對表達量的均數(shù)0.945為臨界值，將鼻咽癌患者分為STAT3 mRNA高表達者41例、低表達者44例，其3年總體生存率分別為48.7%(20/41)、79.5%(35/44)，STAT3 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于STAT3 mRNA低表達者(χ2=4.916，P<0.05)。見圖2。

圖1 鼻咽癌不同JAK2 mRNA表達者的生存曲線

3 討論

鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其發(fā)生可能是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果[7]。目前認為，鼻咽癌是一種多基因遺傳性疾病，其發(fā)生、發(fā)展可能涉及細胞內(nèi)多條細胞信號傳導(dǎo)通路的異常改變，如Wnt通路、Akt通路等[8]，但其確切分子機制仍不十分清楚。因此，深入研究鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找鼻咽癌早期診斷、個體化治療和預(yù)后評估的腫瘤標志物具有重要意義。

圖2 鼻咽癌不同STAT3 mRNA表達者的生存曲線

JAK2為JAK家族成員之一，其基因定位于染色體9p24.1，編碼的蛋白具有非受體蛋白酪氨酸激酶活性，通過參與IL-6、IFN-γ等細胞因子受體信號傳導(dǎo)途徑的信號傳導(dǎo)，參與調(diào)控細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，JAK2異常表達能夠促進腫瘤血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞外基質(zhì)降解等，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。逄明杰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織JAK2異常高表達，其高表達與患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，進一步證實JAK2異常高表達與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)。這可能與腫瘤微環(huán)境中M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌產(chǎn)生IL-17，而IL-17能夠作用于腫瘤細胞表面相應(yīng)受體，通過激活細胞內(nèi)JAK2表達促進下游信號傳導(dǎo)[12]。此外，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多種調(diào)控JAK2表達的微小RNA異常表達，如能夠結(jié)合于JAK2信使RNA的3′端非翻譯區(qū)的miR-375，其異常低表達可導(dǎo)致JAK2表達升高[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與TNM分期有關(guān)，而與性別、年齡、吸煙史、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。表明JAK2異常表達與鼻咽癌TNM分期有關(guān)，其機制可能與JAK2表達升高能夠促進下游細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化，如PI3K/AKT信號通路，導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達異常，從而促進腫瘤惡性進展[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，JAK2 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于JAK2 mRNA低表達者，提示JAK2高表達可能與鼻咽癌患者預(yù)后不良有關(guān)。這可能與JAK2高表達的腫瘤細胞侵襲能力明顯增強有關(guān)。

STAT3是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物，其基因定位于染色體17q21.2，編碼的蛋白主要通過受體酪氨酸激酶磷酸化后活化，形成同源性二聚體結(jié)構(gòu)，由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞核，發(fā)揮核內(nèi)靶基因表達調(diào)控作用。有研究報道，鼻咽癌組織STAT3表達明顯升高，其表達變化與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織STAT3 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，進一步證實STAT3異常高表達與鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān)，其機制可能是調(diào)控STAT3表達的上游細胞信號傳導(dǎo)通路過度活化，如JAK2信號傳導(dǎo)通路等，從而導(dǎo)致STAT3表達增加。此外，STAT3表達還受一些內(nèi)源性抑制因子的調(diào)控，如STAT3的內(nèi)源性抑制因子細胞因子信號抑制因子1(SOCS1)。SOCS1能夠抑制STAT3表達，進而抑制下游信號傳導(dǎo)通路活化[16]。有研究表明，STAT3能夠抑制參與DNA修復(fù)相關(guān)基因Jab1/Csn5表達，導(dǎo)致腫瘤惡性進展，并且降低腫瘤細胞對放化療的敏感性[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與TNM分期有關(guān)，而與性別、年齡、吸煙史、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。表明STAT3異常表達與鼻咽癌TNM分期有關(guān)，其原因可能與STAT3能夠參與調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3 mRNA高表達者3年總體生存率明顯低于STAT3 mRNA低表達者，其原因可能是上游轉(zhuǎn)錄因子等直接促進STAT3表達，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1、Zeste同源染色體2增強子基因等，從而促進鼻咽癌細胞無限增殖，進而導(dǎo)致患者預(yù)后不良[18]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織JAK2 mRNA相對表達量與STAT3 mRNA相對表達量呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者可能共同促進腫瘤進展。目前，二者在鼻咽癌中確切的相互作用機制尚不清楚，可能是JAK2在受到上游信號激活后，STAT3被磷酸化而活化，導(dǎo)致下游Bax/Bcl-xL升高，從而促進腫瘤細胞增殖并抑制其凋亡，同時促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，繼而導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化[19]。

綜上所述，鼻咽癌組織JAK2、STAT3高表達，其表達變化與TNM分期和患者預(yù)后有關(guān)。JAK2、STAT3有可能成為診斷鼻咽癌的腫瘤標志物和治療靶標。