戴利銘，劉一賢，施玉萍，李嵐嵐，張 璇，蔡志英*

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100；2.西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南景洪666100）

橡膠樹種植主要分布在海南、廣東、廣西、福建、云南等地區(qū)，溫暖濕潤(rùn)的氣候非常適宜多種病原微生物的生存繁衍，導(dǎo)致橡膠樹病害種類繁多。目前國(guó)內(nèi)已知危害橡膠樹的病害多達(dá)90 多種，其中葉部病害的病原菌主要有橡膠粉孢屬（Oidium spp.）［1］、炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）［2］、棒孢屬（Corynespora spp.）［3］等。云南省熱帶作物科學(xué)研究所植物保護(hù)和微生物利用中心2015 年在廣東、海南橡膠苗圃病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)1 種新的橡膠樹葉部病害，癥狀表現(xiàn)：葉片感病后，最初出現(xiàn)黃色小斑點(diǎn)，隨后病斑逐漸擴(kuò)展成直徑5～15 mm 的近圓形至不規(guī)則形的灰褐色至灰色病斑。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS 序列分析，鑒定該病原菌為嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratu），為我國(guó)橡膠樹葉片的一種新病害［4］。

蠕形分生孢子真菌是禾本科植物上的常見病原菌，主要包括平臍蠕孢屬（Bipolaria spp.）、彎孢屬（Curvularia spp.）、凸臍蠕孢屬（Exserohilum spp.）、內(nèi)臍蠕孢屬（Drechslera spp.）等，據(jù)報(bào)道該類致病菌引起香蕉葉斑?。?］、牛筋草葉斑?。?］、桂牧葉斑?。?］、玉米葉斑病［8］等。作為蠕形分生孢子真菌之一的嘴突凸臍蠕孢在國(guó)內(nèi)研究報(bào)道的并不多，從不同寄主植物上分離到的嘴突凸臍蠕孢因生長(zhǎng)環(huán)境的不同而存在生物學(xué)上的某些差異。本研究以橡膠樹新葉斑病上分離得的嘴突凸臍蠕孢菌作為研究對(duì)象，采用十字交叉法進(jìn)行生物學(xué)特性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)的研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道于下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌

本研究室前期分離、保存、鑒定的病原菌種［4］。

1.1.2 供試藥劑

木糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、淀粉、果糖、半乳糖、甘油、色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、蛋白胨、硫酸銨、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自昆明拓源公司。

1.1.3 儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州凈化SW-CJ-2FD）、恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特DH5000B Ⅱ）、水浴鍋（德國(guó)HAAHE HAAKEDC100）、分析天平（梅特勒托利多PL203）

1.1.4 培養(yǎng)基

（1）PDA 培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖15 g，瓊脂18 g，水定容至1 000 mL，自然pH；（2）查氏瓊脂培養(yǎng)基（Czapek）：硝酸鈉2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂15～20 g，水定容至1 000 mL。上述培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌20 min 后備用。

1.2 方法

1.2.1 溫度對(duì)病菌生長(zhǎng)的影響

病原菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后用直徑為5 mm 的滅菌打孔器打取菌塊，將菌絲塊面向下接種于備用PDA 培養(yǎng)基中，分別測(cè)定在5、10、15、20、25、28、30、35℃等不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)量（恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)），每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)5 d 后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，參考番華彩方法［7］。

1.2.2 pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

將制成的菌塊接種于不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的PDA 培養(yǎng)基上，測(cè)定不同條件下菌絲生長(zhǎng)情況，方法同1.2.1。

1.2.3 病原菌菌絲的致死溫度

將制成的菌塊置于放有2 mL 無菌水的玻璃試管中，于40、45、50、51、52、53、54、55、60℃等不同溫度條件下恒溫水浴鍋處理10 min，分別取不同溫度處理的菌餅接種于PDA 平板中央，觀察菌落生長(zhǎng)情況，以一支在室溫中放置的試管作為對(duì)照，方法同1.2.1。

1.2.4 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以不含蔗糖的Czapek 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入等量木糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、淀粉、果糖、半乳糖、甘油10 種碳源，制成不同碳源培養(yǎng)基，以Czapek 培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，方法同1.2.1。

1.2.5 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

以色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、蛋白胨、硫酸銨、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸11 種氮源代替Czapek 培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基，測(cè)定氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，方法同1.2.1。

1.2.6 光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

設(shè)24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 黑暗/12 h 光照共3 種光照條件，將病原菌分別置于不同光照條件下培養(yǎng)，測(cè)定光對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，方法同1.2.1。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和多重比較。

2 結(jié)果

2.1 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

對(duì)病原菌菌絲體生長(zhǎng)特性測(cè)定結(jié)果表明（圖1），在10～40℃病原菌都能生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)的溫度范圍為25～30℃，培養(yǎng)5 d 后菌落直徑在70～74 mm，最適溫度為30℃，菌落直徑達(dá)74.08 mm。病原菌菌絲在超過35℃時(shí)對(duì)溫度比較敏感；低于5℃時(shí)菌絲體無法正常生長(zhǎng)。

2.2 pH 對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

從圖2 中可知，在pH 3～9 的范圍內(nèi)，病原菌菌絲生長(zhǎng)存在差異。pH 6～9 時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快，菌落直徑范圍64.60～73.5 mm；當(dāng)pH 值小于4，菌絲雖能正常生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)很緩慢；pH7、pH8 很適合菌絲生長(zhǎng)，菌落直徑達(dá)70.8 mm 和73.5 mm。

2.3 病原菌菌絲的致死溫度

以室溫下的處理作為對(duì)照，設(shè)置了9 個(gè)溫度處理，病原菌在40、45、50、51、52℃處理10 min 后仍然能在PDA 平板上正常生長(zhǎng)；53℃及以上溫度處理10 min 后未生長(zhǎng)（表1）。由此表明，病原菌的致死溫度為53℃，10 min。

表1 菌絲致死溫度測(cè)定

2.4 碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

病原菌在供試的10 種碳源上均可生長(zhǎng)，但對(duì)不同碳源利用程度存在差異（圖3）：對(duì)淀粉利用率最高，菌絲生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d 后菌落直徑達(dá)71.13 mm；在半乳糖、木糖、麥芽糖、乳糖、山梨醇、甘露醇的查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況良好；而在含有甘油的查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受到抑制，菌落直徑為54.5 mm。

2.5 氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，在含有11 種不同氮源的查氏培養(yǎng)基上，該菌生長(zhǎng)狀況存在較大差異：在含有牛肉浸膏和酵母浸膏的查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌落直徑顯著大于其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑，且病原菌生長(zhǎng)旺盛；而在含有丙氨酸、胱氨酸和硫酸銨的查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢；而對(duì)精氨酸、尿素、蛋白胨、甘氨酸、酪氨酸則利用效果一般。

2.6 光照條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響

光照處理5 d 后，發(fā)現(xiàn)24 h 光照和12 h 黑暗/12 h 光照兩種條件下菌絲的菌落生長(zhǎng)速率基本一致，菌落直徑在76.1～77.6 mm；完全黑暗條件下生長(zhǎng)稍慢（圖5）。

3 結(jié)論

云南省熱帶作物科學(xué)研究所從廣東、海南多個(gè)苗圃橡膠葉斑病材料上分離得到的致病菌，經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定為嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratum），首次報(bào)道了嘴突凸臍蠕孢能侵染橡膠葉片引起葉斑病。對(duì)該病菌的生物學(xué)特性研究表明，該病原菌最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃，當(dāng)溫度低于10℃或高于35℃，菌絲生長(zhǎng)受限，這與張弛成［8］在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草種植資源圃進(jìn)行病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的嘴突凸臍蠕孢引起的桂牧葉斑病上分離得到的病原菌相似，其最適生長(zhǎng)的溫度在25～32℃，最適生長(zhǎng)溫度28℃。此外，本項(xiàng)研究的該菌生長(zhǎng)最適pH 7～9，與張弛成報(bào)道的桂牧葉斑病菌研究結(jié)果相接近（pH 為6.5），但研究發(fā)現(xiàn)光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)無顯著影響，這與張弛成和林善海［5］報(bào)道的桂牧葉斑病和香蕉葉斑病研究結(jié)果不同，這或許是由于地域分布不同而造成種間的差異。

研究表明，該菌能利用多種碳源、氮源，其中以蔗糖、木糖、麥芽糖、乳糖、淀粉為碳源生長(zhǎng)較好，對(duì)氮源的利用效率以牛肉浸膏和酵母浸膏為優(yōu)，丙氨酸和硫酸銨為氮源時(shí)嚴(yán)重抑制病原菌生長(zhǎng)。張弛成［8］研究報(bào)道的該菌在含麥芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好，對(duì)氮源的利用效率以硝酸鈉為優(yōu)，牛肉浸膏利用較為一般，尿素為氮源時(shí)嚴(yán)重抑制病原菌生長(zhǎng)?？梢钥闯?，源自不同寄主的嘴突凸臍蠕孢對(duì)碳源和氮源的利用是有差異的。席興文等［9］提出，同屬不同種的菌對(duì)碳源、氮源的利用及培養(yǎng)特征可作為分類鑒定的依據(jù)。而針對(duì)橡膠樹嘴突凸臍蠕孢對(duì)某些碳源、氮源利用效率較低的特點(diǎn)，可以嘗試創(chuàng)新新的防治措施。

據(jù)報(bào)道，嘴突凸臍蠕孢作為植物致病菌危害馬唐草［10］、臺(tái)灣青棗［11］、香牛筋草［12］等。對(duì)于防治，張弛成［8］對(duì)桂牧葉斑病分離得到的病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)嘴突凸臍蠕孢毒力最強(qiáng)的殺菌劑為咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑，EC50分別為0.0071 mg/L 和0.0072 mg/L。由于不同寄主來源的嘴突凸臍蠕孢葉斑病菌株間的生物學(xué)特性存在差異，故對(duì)有效防治橡膠樹嘴突凸臍蠕孢葉斑病的藥劑還需進(jìn)一步研究。