劉玲玲，胡仁靜*，李玉生，崔 燕，馬致遠，范沁榕

（無錫市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 無錫 214000）

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是重癥疾病患者常見的急性并發(fā)癥，這種嚴重的器官功能障礙有很高的發(fā)病率和死亡率，在形成膿毒癥的患者中尤為常見。臨床和實驗工作的重點是確定哪些患者有可能發(fā)展成為AKI，以便在器官損害導(dǎo)致終末期腎病之前采取充分的措施。血清肌酐或尿量是腎損傷的晚期標志物。已經(jīng)有許多用于早期檢測AKI的生物標志物如NGAL、IL-18、KIM-1、IGFBP7、TIMP-2、DDRGK1等[1]，但到目前為止還沒有進入臨床實踐。生物標志物通常只代表腎細胞損傷的指標[2]。相反，參與誘導(dǎo)破壞性的分子更重要的是要識別。最重要的是滅活和消除這些主要源于內(nèi)源性生產(chǎn)的有毒化合物。在這些對腎微血管結(jié)構(gòu)和近端小管造成損害的分子中，有白細胞介素和蛋白酶以及中性粒細胞胞外陷阱(NET)等[3-4]。它們大都是從效應(yīng)細胞中分泌出來的，并對入侵的病原體進行消除。這些效應(yīng)細胞包括淋巴細胞和粒細胞等，前者抗病毒感染和殺傷腫瘤細胞，后者主要作用于細菌和真菌。肝素結(jié)合蛋白(heparin-binding protein,HBP)，是活化的中性粒細胞相關(guān)的囊泡中持續(xù)產(chǎn)生的，已被證明是膿毒癥嚴重程度的重要決定因素。此外，在小鼠模型中，高濃度的HBP已被證明通過間質(zhì)富集蛋白質(zhì)聚集和間質(zhì)出血導(dǎo)致腎損傷，提示血管損傷增加[5]。HBP被認為是膿毒癥的預(yù)測指標，HBP通過增加內(nèi)皮通透性，增強炎癥狀態(tài)和細胞周期阻滯，在AKI發(fā)病中起重要作用。因此，本實驗旨在研究膿毒癥AKI患者血漿中HBP的水平，并初步探討其對于AKI分期的診斷意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月至2020年6月期間來無錫市第二人民院就診的90例18歲以上符合膿毒癥標準的門診病人的血液樣本，排除標準是18歲以下艾滋病毒或丙型肝炎病毒等傳染病患者。從90例患者中采集靜脈血樣，45例有AKI的膿毒癥患者作為實驗組，45例性別和年齡匹配的無AKI的膿毒癥患者作為對照組。采血后30min內(nèi)離心取血漿-70℃儲存。并記錄90例患者的年齡，性別，C反應(yīng)蛋白數(shù)值，白細胞計數(shù)數(shù)值，血液肌酐的數(shù)值，24小時尿量等數(shù)據(jù)。

1.2 儀器與試劑

本科室所用iMark 酶標儀（美國伯樂公司），洗板機（鄭州新科技有限公司），肝素結(jié)合蛋白測定試劑盒（中翰盛泰器械有限公司）。

1.3 實驗方法

加100μL校準品A-F、質(zhì)控品和實驗樣本至酶標板相應(yīng)的孔中，18-25℃孵育60分鐘，洗板機洗滌三次后加入100μL酶結(jié)合物，18-25℃孵育60分鐘，洗滌三次后加入100μL底物，18-25℃孵育10分鐘，加入100μL終止液，混勻，10分鐘內(nèi)在450nm波長的酶標儀上讀數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)回歸分析及ROC分析。

2 結(jié) 果

2.1 感染相關(guān)指標結(jié)果比較

本研究評估了45例有AKI的膿毒癥患者(29例AKIⅠ期患者、7例AKIⅡ期患者和9例AKI Ⅲ期患者)和45例無AKI的膿毒癥患者的肝素結(jié)合蛋白水平。有AKI的膿毒癥患者血漿中的肝素結(jié)合蛋白水平明顯高于無AKI的膿毒癥患者，而且AKI分期越高，肝素結(jié)合蛋白的含量越多。多元回歸分析顯示，HBP（峰值和平均水平）與性別、年齡、血清C反應(yīng)蛋白、白細胞計數(shù)之間沒有關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表明，峰值HBP和平均HBP都可以用來區(qū)分AKI和非AKI，峰值HBP顯示出更高的區(qū)分水平。具體結(jié)果見表1。

表1 HBP與AKI及性別、年齡、血清C反應(yīng)蛋白、白細胞計數(shù)關(guān)系表

2.2 血漿肝素結(jié)合蛋白ROC分析

對血漿肝素結(jié)合蛋白診斷膿毒癥AKI患者的敏感性和特異性進行了ROC分析，以評估血漿HBP是否為診斷和鑒別AKI分期的有效指標。最佳峰值HBP截止值為23.89 ng/mL(95%CI[7.07-40.72])，用于區(qū)分AKI與非AKI，其靈敏度和特異性為0.79和0.56，AUC為0.67(95%CI[0.46-0.87]。對于平均HBP，AKI與非AKI的最佳截止值為20.46 ng/mL(95%CI[8.53-32.39])，試驗的敏感性和特異性分別為0.73和0.56，AUC為0.61(95%CI[0.40-0.81])。上述見圖1

圖 1 HBP 對有AKI和無AKI患者的ROC分析圖

3 討 論

在本研究中，我們評估中性粒細胞衍生的HBP是否為膿毒癥急性腎損傷的指標。在伴有AKI的膿毒癥患者中，HBP顯著升高，并與急性腎功能衰竭的嚴重程度進一步相關(guān)，HBP水平在AKI Ⅲ 期最高。值得一提的是，在我們的研究中，9例AKI Ⅲ 期患者中有8例需要腎臟替代治療(RRT)。有研究表明，雖然腎損害可能導(dǎo)致HBP的腎清除率高于健康個體，但通過持續(xù)的RRT，HBP水平?jīng)]有顯著降低[6]。本實驗證實了他的結(jié)論，接受RRT的AKI Ⅲ 期患者的HBP水平最高。肝素結(jié)合蛋白作為血液循環(huán)中中性粒細胞衍生物質(zhì)的重要指標，以前曾在動物模型中對AKI進行過研究，并被證明與膿毒癥中影響腎單位的病理有關(guān)。雖然在一些實驗中，沒有蛋白酶活性被歸因于這種分子，但它是中性粒細胞活化和脫顆粒的理想指標。當(dāng)檢測到HBP水平升高時，其他蛋白酶也會釋放到血液循環(huán)中。對中性粒細胞衍生細胞產(chǎn)物的病理機制和細胞破壞過程的啟動進行了大量的研究。一方面，中性粒細胞胞外陷阱(NET)已被證明通過激活凝血過程和內(nèi)皮損傷觸發(fā)級聯(lián)，導(dǎo)致血栓性微血管病變。另一方面，各種蛋白酶敏感受體在內(nèi)皮細胞表面表達，在切割時可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化。內(nèi)皮細胞的激活需要增加血管床的通透性和液體外滲。 這對腎單位的微環(huán)境特別重要，特別是在近端小管上微調(diào)平衡的干擾導(dǎo)致流體、電解質(zhì)和底物再吸收的損害。 近端腎小管細胞的不平衡可能導(dǎo)致細胞極性喪失、刷緣喪失和與AKI相關(guān)的鑄型形成等病理。對于臨床實踐，這表明早期干預(yù)，在膿毒癥導(dǎo)致中性粒細胞過度脫顆粒之前，可能對防止細胞損傷具有重要意義。作為中性粒細胞來源的指示蛋白，在膿毒癥AKI患者中檢測到HBP水平顯著升高。以往的研究表明，HBP在膿毒癥、心臟和呼吸衰竭以及各種感染過程中參與血管滲漏、趨化和炎癥的分子病理機制[7]。 它不僅被認為是一個有前途的診斷指標，而且與疾病的嚴重程度具有預(yù)后相關(guān)性[8]。我們研究的主要局限性是回顧性，由于預(yù)先定義的研究條件，從而限制了分析的數(shù)量，此外，沒有用尿液標本驗證本實驗，一方面是因為很多患者出現(xiàn)無尿，另一方面是因為用于HBP分析的檢測在技術(shù)上不被批準用于尿液樣本。本研究的目的不是確定HBP在膿毒癥期間AKI發(fā)病機制中的作用，而是探討它在膿毒癥AKI患者診斷中的意義。本實驗提供了HBP截斷值來檢測膿毒癥AKI患者，并證明HBP是一種新型、快速、有效的膿毒癥AKI患者診斷的生物標志物。本研究不僅探討了肝素結(jié)合蛋白對于膿毒癥AKI及其分期診斷的意義，而且為今后研究膿毒癥AKI的發(fā)病機制和治療方法提供了依據(jù)。