陳瓊,吳菲菲,李化強(qiáng),劉亞美,王恒震,張?jiān)缑?/p>

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽(yáng),422000)

杠板歸(polygonumperfoliatumL)是湖南特色中藥材,又名犁頭刺、貫葉蓼、蛇不過(guò)等,屬于蓼科蓼屬(polygonaceae),收載于《中華人民共和國(guó)藥典》一部(2010年版)[1],杠板歸是我們生活中常見(jiàn)的一種中草藥[2],有研究表明,杠板歸具有多種生物活性成分,主要有酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、揮發(fā)油、蒽醌等[3-4]。其中多酚類(lèi)化合物在清熱解毒、利水消腫、蛇蟲(chóng)咬傷等方面起著不可或缺的作用,是杠板歸中一種重要的生物活性物質(zhì)[5-8]。目前,杠板歸的研究主要集中在多糖和黃酮的提取及其藥理作用[9-11],幾乎沒(méi)有關(guān)于杠板歸多酚提取的報(bào)道。多酚的方法主要有機(jī)溶劑回流法、超聲輔助提取法、酶法及超臨界流體萃取法等[12-14]。而超聲結(jié)合表面活性劑提取方法,主要是利用超聲非熱加工的特點(diǎn),與表面活性劑的潤(rùn)濕、增溶作用相結(jié)合,達(dá)到節(jié)能省時(shí)、提高含量等效果,更有利于活性成分的溶出[15-17]。本試驗(yàn)中采用超聲與吐溫80協(xié)同提取法,通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選杠板歸多酚的提取工藝條件,并研究其體外抗氧化活性,為杠板歸作為藥食同源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力提供理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杠板歸:邵陽(yáng)本地大藥房,粉碎過(guò)80目(0.180 mm)篩備用；

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、Folin-Ciocalteu試劑、抗壞血酸、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺為分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司；

吐溫80、亞硝酸鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸為分析純,邵陽(yáng)市科儀?；邢薰?。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī):FW400A型,北京科偉永興儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī):SCIENTZ-18N型,寧波新芝生物科技股份有限公司；

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-5299型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

超聲波清洗機(jī):SB5200DTD型,寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度計(jì):UV-1780型,日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 杠板歸預(yù)處理及提取工藝

精密稱取2 g(精確到0.000 1 g)的杠板歸粉末置于100 mL的錐形瓶中,再加入一定量的吐溫80水溶液進(jìn)行超聲提取,于10 000 r/min的條件下離心10 min后得上清液,過(guò)濾,合并濾液,得到待測(cè)液備用。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

1)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。以沒(méi)食子酸為對(duì)照品,采用Folin-Ciocalteu法[18]測(cè)定多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(X)與吸光度(Y)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=5.457 1X-0.007 9(R2=0.997 9),線性相關(guān)性良好。

2)樣品中總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作法測(cè)定吸光度,根據(jù)方程計(jì)算杠板歸多酚得率。計(jì)算公式:

總酚得率=(C×V×n)/1 000/m×100%

式中:C為根據(jù)回歸方程計(jì)算得到的質(zhì)量濃度，g/L；V為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為杠板歸粉末的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素實(shí)驗(yàn)探究了5個(gè)因素對(duì)杠板歸多酚得率的影響,其中超聲溫度分別為40，50，60，70和80 ℃；吐溫80質(zhì)量濃度分別為10%，15%，20%，25%和30%；超聲功率分別為150，180，210，240和270 W；液料比分別為10∶1 ，15∶1 ，20∶1 ，25∶1和30∶1 mL/g；超聲時(shí)間分別為20，30，40，50和60 min。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)為杠板歸多酚得率,每個(gè)重復(fù)3次。

1.3.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,考察液料比(A)、超聲時(shí)間(B)、吐溫80質(zhì)量濃度(C)、超聲功率(D)、超聲溫度(E)5個(gè)因素,以多酚得率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn),確定杠板歸多酚的最佳提取工藝條件。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平
Table 1 Orthogonal test factors and levels

水平A液料比/(mL·g-1)B超聲時(shí)間/minC吐溫80質(zhì)量濃度/%D超聲功率/WE超聲溫度/℃110∶1201015040215∶1301518050320∶1402021060425∶1502524070

1.3.5 體外抗氧化活性研究

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲溫度

超聲溫度對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖1。圖1表明：在40～80 ℃的范圍內(nèi),多酚得率先逐漸升高,隨著溫度的逐漸升高，各物質(zhì)之間的運(yùn)動(dòng)速度增大,吐溫80水溶液滲透到杠板歸原料內(nèi)的能力和多酚的溶解度增大,增加了多酚得率；而當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí),其熱不穩(wěn)定性使多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞,從而導(dǎo)致多酚得率下降。因此,確定60 ℃為較佳的提取超聲溫度。

圖1 超聲溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polyphenols

圖2 吐溫80質(zhì)量濃度對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effect of Tween 80 concentration on the extraction rate of polyphenols

2.1.2 吐溫80質(zhì)量濃度

吐溫80質(zhì)量濃度對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖2。圖2表明：在吐溫質(zhì)量濃度為10%～20%時(shí),多酚得率隨著吐溫80質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)增大的趨勢(shì),這是由于吐溫80作為增溶劑,更有利于多酚的溶出；但當(dāng)質(zhì)量濃度大于20%時(shí),得率開(kāi)始呈下降趨勢(shì),原因可能是當(dāng)質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)形成了膠束,多酚物質(zhì)進(jìn)入膠束中后再溶出受阻,導(dǎo)致多酚得率下降[22]。因此,確定20%為較佳的提取吐溫80質(zhì)量濃度。

2.1.3 超聲功率

超聲功率對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖3。圖3表明：在150～270 W范圍內(nèi),隨著超聲功率增大,杠板歸多酚得率緩慢升高。這是由于超聲波提取主要是利用超聲波的特性,如溫?zé)嵝?yīng)使能量轉(zhuǎn)換、物理化學(xué)變化等等,此時(shí)分子運(yùn)動(dòng)速度增大,從而加速多酚溶出,提高了多酚得率[23]。多酚得率在超聲功率達(dá)到180 W時(shí)達(dá)到最高。因此,確定180 W為較佳的提取超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polyphenols

2.1.4 液料比

液料比對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖4。圖4表明：在液料比為10∶1～30∶1 mL/g時(shí),隨著液料比的增大,杠板歸多酚的得率先增后降,15∶1 mL/g時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于料液比較低時(shí),原料和吐溫80水溶液接觸不充分,導(dǎo)致細(xì)胞中的多酚不易溶出；當(dāng)體系中的溶劑量過(guò)多時(shí),會(huì)降低超聲波的超聲效果,同時(shí)樣品在后處理濃縮過(guò)程中多酚的損失增加[24]。因此,確定15∶1 mL/g為較佳的提取液料比。

圖4 液料比對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effect of liquid to material ratio on the extraction rate of polyphenols

圖5 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polyphenols

2.1.5 超聲時(shí)間

超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響見(jiàn)圖5。圖5表明：在超聲時(shí)間20～60 min范圍內(nèi),隨著超聲時(shí)間的增加，多酚得率增加,在40 min時(shí)多酚的溶出量最大,提取效果最好,超聲波對(duì)物料的作用較充分；之后再延長(zhǎng)提取時(shí)間,多酚得率反而下降,超聲波較強(qiáng)的剪切作用會(huì)破壞多酚的分子結(jié)構(gòu)[25-26],并且多酚與外界環(huán)境接觸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致氧化和分解[27]。因此,確定40 min為較佳的提取超聲時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
Table 2 Design and results of orthogonal experiments

試驗(yàn)號(hào)ABCDE多酚得率/%11111116.9821222217.3131333317.5341444418.6352123417.1462214318.2272341218.0382432116.9793134218.53103243117.94113312418.11123421318.14134142317.54144231419.16154324118.09164413217.54K117.61317.54717.71218.07817.495K217.59018.15717.67017.48317.852K318.18017.94018.04717.53817.858K418.08317.82018.03518.36718.260R0.5900.6100.3770.8840.765最優(yōu)方案A3B2C3D4E4

由表2看出各個(gè)單因素對(duì)杠板歸中多酚得率的影響順序?yàn)椋篋>E>B>A>C即超聲功率>超聲溫度>超聲時(shí)間>液料比>吐溫80質(zhì)量濃度。提取最佳工藝條件為A3B2C3D4E4,即液料比為20∶1 mL/g，超聲時(shí)間為30 min，吐溫80質(zhì)量濃度為20%，超聲溫度為70 ℃，超聲功率為240 W。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)中得到的最佳提取方案再次進(jìn)行杠板歸多酚的提取來(lái)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明：當(dāng)多酚提取效果高于以上16個(gè)試驗(yàn)組合時(shí),多酚得率為(19.87±0.17)%,在此工藝條件下重復(fù)性好,穩(wěn)定可行。

2.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力見(jiàn)圖6。由圖6可知：杠板歸多酚提取物(PPP)和VC都有清除DPPH自由基的作用；隨著其質(zhì)量濃度的不斷增大,兩者對(duì)DPPH自由基的清除能力隨之逐漸增強(qiáng)最后趨于穩(wěn)定；在質(zhì)量濃度為30～150 mg/L時(shí),杠板歸多酚提取物對(duì)DPPH自由基的清除率最大達(dá)到73.34%,從整體來(lái)看,杠板歸多酚提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

圖6 多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of polyphenols on DPPH radicals

圖7 多酚對(duì)自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of polyphenols on radicals

2.6 總還原能力的測(cè)定

先前已有報(bào)道,抗氧化活性與植物提取物的還原能力之間存在直接關(guān)聯(lián),化合物的還原能力可作為其潛在抗氧化活性的重要指標(biāo)[28]。杠板歸多酚提取物(PPP)和VC的還原能力如圖8所示。從圖8可見(jiàn)：在多酚質(zhì)量濃度為30～150 mg/L時(shí),隨著多酚質(zhì)量濃度的不斷增大,兩者的還原能力相應(yīng)提高,且多酚提取物的還原能力大于同質(zhì)量濃度的VC還原能力。從整體來(lái)看,杠板歸多酚提取物的總還原能力強(qiáng)于VC。

圖8 多酚的總還原能力Fig.8 Total reducing power of polyphenols

3 結(jié)論

杠板歸多酚的最佳提取條件如下：液料比為20∶1 mL/g，超聲時(shí)間為30 min，吐溫80質(zhì)量濃度為20%，超聲溫度為70 ℃、超聲功率為240 W,在此條件下,多酚得率達(dá)到(19.87±0.17)%。杠板歸多酚提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性,且清除效果與質(zhì)量濃度相關(guān),在相同質(zhì)量濃度下，杠板歸多酚提取物對(duì)DPPH自由基的清除率及總還原能力優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照VC。下一步還需對(duì)其進(jìn)行分離純化,對(duì)其結(jié)構(gòu)、活性的研究深入探索,以鑒定出抗氧化的主要活性化合物。