高嘉沛 林仕鈺 張景怡

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西咸陽 712100）

我國主要栽種的葡萄品種為歐洲葡萄，其品質(zhì)優(yōu)良，但易染病且多為真菌病害[1]。葡萄黑痘病在世界葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，尤以多雨潮濕地區(qū)受害嚴(yán)重[1]。我國的葡萄主栽品種易感黑痘病[2]，每年由于黑痘病使葡萄產(chǎn)量減產(chǎn)約18.5%[3]，且品質(zhì)大幅下降。因此，如何提高葡萄自身抗病性是現(xiàn)階段葡萄抗病育種工作的一大難點(diǎn)。本研究以感病的歐洲葡萄無核白與抗病的毛葡萄商-24為研究材料，通過半定量RT-PCR與熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)ERF家族進(jìn)行了其在葡萄受黑痘病侵染后應(yīng)答過程中的基因表達(dá)分析。

1 實(shí)驗(yàn)方法

本研究以Li Zhi等[4]的方法對(duì)葡萄黑痘菌進(jìn)行分離并培養(yǎng)，取無核白與商-24幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，將黑痘菌活化1 d后配置濃度均一的孢子懸浮液，均勻噴灑于材料，在23 ℃的環(huán)境中進(jìn)行保濕培養(yǎng)，并在接種后的12、24、48、72 h收集樣品及空白對(duì)照。用天根植物RNA提取試劑盒提取mRNA，檢驗(yàn)純度后，用TaKaRa試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)篩選ERF家族基因，用PrimerPremier5設(shè)計(jì)引物并檢驗(yàn)其特異性。以相應(yīng)cDNA為模板進(jìn)行RTPCR（體系為20 μL），產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳、EB染色進(jìn)行半定量分析。定量分析主要操作與半定量分析相同，但在體系中加入熒光染料以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 半定量分析結(jié)果本實(shí)驗(yàn)首先利用半定量RT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)接種黑痘菌后無核白中VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF24、VvERF33、VvERF35和 VvERF47的 表達(dá)與對(duì)照相比出現(xiàn)差異；商-24中VvERF02、VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF33、VvERF35、VvERF47、VvERF57和VvERF64出現(xiàn)差異。其中，有6個(gè)基因（VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF33、VvERF35和VvERF47） 在兩個(gè)品種中均有強(qiáng)烈的響應(yīng)。

2.2 定量分析結(jié)果對(duì)上述6個(gè)基因進(jìn)行定量分析，顯著表現(xiàn)出上調(diào)趨勢的基因定量分析結(jié)果如圖1所示。由圖可以看出，VvERF12在處理下顯著上調(diào)，VvERF33除了無核白的24 h樣品外顯著上調(diào)，考慮可能存在一定的實(shí)驗(yàn)誤差。

圖1 葡萄ERF基因在黑痘菌感染處理下的定量分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄中的ERF家族基因進(jìn)行了鑒定，半定量分析發(fā)現(xiàn)對(duì)黑痘菌侵染應(yīng)答中表現(xiàn)出顯著響應(yīng)的有VvERF12、VvERF17、VvERF21、VvERF33、VvERF35和VvERF47； 定量分析發(fā)現(xiàn)其中顯著上調(diào)的基因是VvERF12和VvERF33。