倪 明，吳高泉，何涓源，李煜林

(1.湖北師范大學(xué) 食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002；2.湖北師范大學(xué) 生物學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)示范中心，湖北 黃石 435002；3.湖北師范大學(xué) 文理學(xué)院，湖北 黃石 435002 )

0 引言

側(cè)柏別名崖柏、香柏、松蟠，一般生長在石灰?guī)r山地或潮濕肥饒的地方，為中國特產(chǎn)，除青海、新疆外，中國各地均有種植。黃酮類化合物是一類普遍存在于植物界的次生代謝產(chǎn)物，其功效及成分來源尤為多樣[1]，藥物的毒副作用也少，并且擁有預(yù)防癌癥、消除自由基、降低血糖和抵抗炎癥等藥理活性[2]。目前，側(cè)柏葉的總黃酮提取工藝研究很多[3～5]，但與側(cè)柏果實(shí)總黃酮提取有關(guān)聯(lián)的研究文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。為了更好地開發(fā)利用側(cè)柏，我們決定開展側(cè)柏果實(shí)黃酮提取工藝研究。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料 側(cè)柏果實(shí)摘自于湖北師范大學(xué)。

1.1.2 儀器設(shè)備 試驗(yàn)室粉碎磨(JFSD-70型，上海嘉定糧油儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4型，金壇市醫(yī)療儀器廠)；電子分析天平(BSA124S型，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D型，鞏義市英峪予華儀器廠)；電熱恒溫干燥箱(SKG-02型，黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司)；冰箱(BCD-196KTX型，青島海爾股份有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(UV754N型，上海楚定分析儀器有限公司)。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 硝酸鋁(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海金穗生物科技有限公司)；氫氧化鈉(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；亞硝酸鈉(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；石油醚(60～90℃)(分析純，上海國藥試劑集團(tuán))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 采集新鮮的側(cè)柏果實(shí)，蒸餾水清洗，自然風(fēng)干后剪成細(xì)小碎塊，放入60℃烘箱中烘干并研磨，過60目篩之后再放入烘箱中烘干。將側(cè)柏果實(shí)干燥粉末裝入自制濾紙筒，密封后置于索氏提取器中，加入適量石油醚回流脫脂、脫色，直至提取管內(nèi)溶液無色為止。將脫色后的側(cè)柏果實(shí)粉末烘干至恒重后，置于干燥器中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 蘆丁在烘箱120℃中烘至恒重，冷卻后精確稱取0.025 g，用濃度為95%的乙醇溶解所稱取蘆丁，充分溶解后將之轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中定容到刻度線，這樣就可以得到質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別加入7只25 mL比色管中，依次加入5%的NaNO2試劑1 mL，搖晃反應(yīng)6 min，依次加入10%的Al(NO3)3試劑1 mL，搖晃反應(yīng)6 min，依次加入10%的NaOH試劑10 mL，然后用95%的乙醇溶液定容到25 mL，充分搖晃，靜置15 min .以空白組作為對照，在504 nm處用紫外分光光度計(jì)測定各組吸光值(A)[6].

1.2.3 樣品總黃酮提取及含量的測定 稱取0.500 g預(yù)處理后的側(cè)柏果實(shí)粉置于50 mL圓底燒瓶中，在水浴鍋中使用乙醇溶液浸提，在一定溫度下水浴回流一段時(shí)間后，進(jìn)行減壓抽濾，濾餅用適量乙醇溶液洗滌三次，合并濾液定容，得到樣液。

樣液測定總黃酮含量：取樣液1 mL置于25 mL比色管中，加5%的NaNO2試劑1 mL，搖勻反應(yīng)6 min，再加10%的Al(NO3)3試劑1 mL，搖勻反應(yīng)6 min，加10%的NaOH試劑10 mL，搖勻，用濃度為95%的乙醇試劑定容到25 mL，靜置15 min后，以空白試劑為對照，于504 nm用紫外分光光度計(jì)測定其吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到總黃酮含量。然后即可計(jì)算總黃酮得率：

總黃酮得率 = (C×V)×100%/(M×1000)

式中：C——樣品液的質(zhì)量濃度(mg/mL)；

V——總提取液體積(mL)；

M——預(yù)處理后的側(cè)柏果實(shí)粉質(zhì)量(g).

1.2.4 側(cè)柏果實(shí)總黃酮提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為最終評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)的提取最優(yōu)條件，每個(gè)因素確定三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照1.2.3的方法測出吸光度值后，以吸光度為縱坐標(biāo)，以蘆丁含量(mg)為橫坐標(biāo)，制圖(如圖1所示)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.4896x-0.0004，R2= 0.9997.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 側(cè)柏果實(shí)總黃酮提取的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，確定提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比的因素水平(見表1)，根據(jù)表1利用正交設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過試驗(yàn)得到側(cè)柏果實(shí)總黃酮的得率(見表2)。

表1 側(cè)柏果實(shí)總黃酮提取的正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

由表2極差R分析可得到，這四種因素對側(cè)柏果實(shí)總黃酮得率的影響排序?yàn)椋禾崛囟?乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間>料液比。由表2可得理論最優(yōu)組合為A3B2C3D3，對該理論最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的得率10.71%，結(jié)果表明這個(gè)條件下得率最高。為了驗(yàn)證試驗(yàn)重復(fù)性，在最佳提取條件下，反復(fù)進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，依次得到側(cè)柏果實(shí)黃總酮得率為10.43%、10.31%、10.18%，從而得出側(cè)柏果實(shí)總黃酮的平均得率為10.30%.

表2 側(cè)柏果實(shí)總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)表

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以乙醇溶液為溶劑，以側(cè)柏果實(shí)總黃酮得率為考察對象，通過對溫度、料液比、時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到側(cè)柏果實(shí)總黃酮最佳提取工藝為：料液比為1∶70，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取溫度為100℃，提取時(shí)間為8 h，在此條件下得率達(dá)到10.71%.