周春權(quán) 趙 立 蔣 暢 李細(xì)彬 胡 娟.3

1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建省寧德市閩東畬族青草藥發(fā)展協(xié)會(huì)，福建 寧德 352100； 3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

“十二時(shí)辰”為福建福安民間畬醫(yī)習(xí)用藥，根據(jù)《福安畬醫(yī)畬藥》記載，其性溫，味辛，具有通經(jīng)活絡(luò)、通關(guān)竅、祛風(fēng)除濕、活血止痛、理氣通便、利尿等功效[1]，黃澤豪等[2]對(duì)其進(jìn)行本草考證，福安“十二時(shí)辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮ClematisfloridaThunb.var.plena D.Don的干燥根。重瓣鐵線蓮具有多種生物活性化學(xué)成分，林玲等[3]對(duì)福安的重瓣鐵線蓮的化學(xué)成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其可能含有氨基酸、蛋白質(zhì)、還原糖、多糖、皂苷類、生物堿、黃酮類以及少量的酚類和鞣質(zhì)、有機(jī)酸、內(nèi)酯、香豆素、揮發(fā)油、甾體和萜類等化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明具有抗炎、抗腫瘤、祛風(fēng)除濕、解毒消腫等作用。葉麗穎等[4]發(fā)現(xiàn)鐵線蓮提取物具有一定的抗氧化能力和抑菌能力，能抑制脂質(zhì)體過氧化，清除超氧陰離子；能抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和枯草芽孢桿菌的生長。

“十二時(shí)辰”作為畬族民間習(xí)用藥，具有鮮明的地方與民族特色。當(dāng)?shù)鼐用裼谩笆r(shí)辰”泡酒，藥液作為皮膚外用藥，用來治療跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛等。本實(shí)驗(yàn)室前期觀察到“十二時(shí)辰”水煎劑小鼠灌胃急性毒性的半數(shù)致死量為60.08g/kg[5]。為分析“十二時(shí)辰”醇提液作為皮膚用藥的毒性，項(xiàng)目組參照《中藥藥理研究方法學(xué)》皮膚用藥毒性試驗(yàn)方法[6]，進(jìn)行“十二時(shí)辰”皮膚用藥慢性毒性試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭家兔，雌雄各半，(1.5±0.2) kg，購自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場，合格證號(hào)：20170008000087。

1.2 藥物 “十二時(shí)辰”生藥(閩東畬族青草藥發(fā)展協(xié)會(huì)提供)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明教授鑒定為毛茛科植物重瓣鐵線蓮ClematisfloridaThunb.var.plena D.Don 的干燥根,本實(shí)驗(yàn)采用65%的乙醇提取濃縮制備，每毫升含生藥1.0 g。 詩妃脫毛膏(批號(hào)：PSHG028，廣州詩妃生物科技有限公司)。

1.3 儀器 YP502N電子天平(上海精密科學(xué)有限公司)；AU480全自動(dòng)生化儀(貝克曼)；XT2000i全自動(dòng)血液分析儀(SYSMEX)；DMi8顯微鏡(LEICA)

2 方法

2.1 分組 通過前期的皮膚用藥急性毒性試驗(yàn)，未觀察到毒性反應(yīng)，可能是毒性較小，則采用最大濃度最大耐受量進(jìn)行家兔慢性毒性試驗(yàn)，最大濃度為1.0 g/mL原藥材。將健康的新西蘭家兔隨機(jī)分成4組，即正常對(duì)照組(涂賦形劑30%乙醇)、“十二時(shí)辰”高劑量組(1.0 g/mL)、中劑量組(0.5 g/mL)、低劑量組(0.25 g/mL)，每組6只，雌雄各半。

2.2 給藥方法與觀察[7]給藥前24 h先用電推剪在背部剃毛，然后用詩妃脫毛膏脫毛，脫毛面積約150 cm2。給藥途徑與臨床一致，采用皮膚給藥，每只家兔脫毛區(qū)固定時(shí)間涂藥5 mL，涂藥后用紗布固定, 家兔分籠飼養(yǎng)，連續(xù)用藥30 d。末次給藥后動(dòng)物禁食不禁水16 h，用10% 的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉。將麻醉后的動(dòng)物仰臥固定，使用一次性采血針從腹主動(dòng)脈采血，血樣用于血常規(guī)和血生化檢測。采血完后處死動(dòng)物，解剖動(dòng)物，摘取動(dòng)物下列臟器：腦、心、肝、脾、肺、腎(單側(cè))、胸腺、腎上腺(單側(cè))、睪丸(單側(cè))、附睪(單側(cè))子宮、卵巢(單側(cè))分別稱重，并計(jì)算主要臟器系數(shù)。計(jì)算公式如下：

臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%

2.3 HE染色病理切片 檢查稱重后，各臟器均浸入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用于HE(hematoxylin-eosin staining)染色病理切片。將固定后的主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)進(jìn)行修樣后，在脫水機(jī)內(nèi)進(jìn)行梯度脫水及透明。將脫水后的樣本取出，進(jìn)行石蠟包埋。將包埋后的組織樣本固定在切片機(jī)上切片，然后在溫水(42～46℃)中展平、貼片，最后置入烘箱內(nèi)過夜烘干。次日在二甲苯和乙醇濃度梯度中使切片脫蠟，然后進(jìn)行HE染色，最后進(jìn)行顯微鏡檢查并拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 資料采用SPSS14.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差齊時(shí)兩均數(shù)比較用LSD，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況和體重增長的影響 用藥組與對(duì)照組相比，未觀察到家兔的活動(dòng)、 飲食、皮毛光澤的異常，家兔體重隨時(shí)間推移而增加，與正常對(duì)照組比無明顯變化(P>0.05)(見表l) 。結(jié)果顯示“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥30 d對(duì)家兔的體重變化無影響。

組別 實(shí)驗(yàn)前體重/kg實(shí)驗(yàn)后體重/kg低劑量組2.317±0.0262.767±0.075中劑量組2.333±0.0412.717±0.113高劑量組2.325±0.0272.783±0.098正常對(duì)照組2.350±0.0452.775±0.094

3.2 對(duì)家兔主要臟器的臟器系數(shù)的影響 取家兔心、腦、肝、脾、肺、腎、胸腺等主要臟器稱重并計(jì)算其臟器指數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組家兔主要臟器的臟器系數(shù)與正常對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 說明“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥30天對(duì)家兔的主要臟器無影響。見表2。

3.3 對(duì)家兔血常規(guī)的影響 取各組家兔的血清進(jìn)行血常規(guī)檢查，各給藥組連續(xù)涂抹“十二時(shí)辰”醇提液30 d后對(duì)家兔血常規(guī)無明顯影響，均在正常值范圍內(nèi)。見表3。

3.4 對(duì)家兔血液生化的影響對(duì)各組家兔血清進(jìn)行血液生化檢測，給藥組連續(xù)涂抹“十二時(shí)辰”醇提液30 d后對(duì)家兔血生化指標(biāo)無明顯影響，均在正常值范圍內(nèi)。見表4。

3.5 對(duì)組織學(xué)的影響 取各組家兔的心、肝、脾、肺、腎、等各臟器組織進(jìn)行HE染色，顯微鏡拍照，由圖1可知，“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥30 d對(duì)家兔主要臟器的組織形態(tài)正常，界限分明，未見明顯異常。

組別肺胸腺腎上腺睪丸附睪子宮卵巢低劑量組0.37±0.0330.16±0.0140.004±0.00020.037±0.0050.037±0.0030.019±0.0010.004±0.0004中劑量組0.37±0.0280.17±0.0080.004±0.00050.048±0.0070.053±0.0110.019±0.0010.003±0.0007高劑量組0.39±0.0370.18±0.0210.005±0.00060.039±0.0060.034±0.0060.020±0.0010.004±0.0001正常對(duì)照組0.36±0.0260.17±0.0070.004±0.00030.038±0.0050.037±0.0000.019±0.0010.004±0.0003

續(xù)表2

組別平均血小板體積血小板體積分布寬度血小板壓積/%大血小板細(xì)胞數(shù)/109/L大血小板細(xì)胞比例/%低劑量組5.92±0.6615.02±0.220.19±0.0323.40±2.706.44±2.05中劑量組5.94±0.5815.18±0.560.23±0.0626.80±4.767.08±2.78高劑量組5.90±0.5315.00±0.300.24±0.0525.40±5.136.66±2.55正常對(duì)照組6.04±0.4815.34±0.400.21±0.0524.60±5.226.94±2.89

續(xù)表3

續(xù)表3

續(xù)表3

組別總蛋白白蛋白球蛋白谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶尿素氮肌酐尿酸高劑量組56.20±2.5443.47±2.3312.73±0.9350.55±12.0726.27±8.967.63±0.8295.08±6.8017.57±8.45中劑量組58.40±2.7443.68±2.8414.75±1.1552.02±14.5330.88±7.297.79±1.11100.65±5.3318.18±6.08低劑量組54.95±2.7241.52±1.4414.22±3.2747.12±9.1428.32±6.387.14±0.7794.98±8.6619.57±5.72正常對(duì)照組55.62±3.5843.92±2.1012.73±0.4449.63±7.4228.98±5.617.48±0.7993.97±6.1018.47±7.44

續(xù)表4

4 討論

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)“十二時(shí)辰”水煎劑作為內(nèi)服的毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其水煎劑小鼠灌胃有一定的毒性作用，半數(shù)致死量 (LD50)為60.08g/kg[5]。其口服有一定的毒性反應(yīng)，那么作為外用制劑，是否也會(huì)有一定的毒性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室采用醇提液進(jìn)行了一系列的皮膚用藥安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，皮膚給藥急性毒性試驗(yàn)、皮膚刺激試驗(yàn)、皮膚過敏試驗(yàn)，均未見毒性反應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)用十二時(shí)辰對(duì)家兔皮膚進(jìn)行30 d涂皮實(shí)驗(yàn)研究，在本實(shí)驗(yàn)條件下，30 d涂皮試驗(yàn)的3個(gè)劑量組(5.0、2.5、1.25 g生藥/只)，其體重、血常規(guī)和生化檢測指標(biāo)，與正常對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，HE染色病理組織學(xué)檢查結(jié)果也表明各試驗(yàn)組家兔的心、肝、脾、肺、腎睪丸、卵巢等組織均未見病理性損傷。表明該樣品外用涂皮對(duì)家兔的生長發(fā)育無不良影響。對(duì)畬藥“十二時(shí)辰”醇提液外用于活血化瘀，治療跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛等臨床具有積極的參考價(jià)值。

畬藥“十二時(shí)辰”屬于福建福安地區(qū)畬族藥，在當(dāng)?shù)匾延?00多年的使用歷史，具有鮮明的地方與民族特色，現(xiàn)在當(dāng)?shù)亻_始進(jìn)行大量的人工栽培，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入來源的一大部分，其在畬族民間也得到廣泛應(yīng)用，民間既可用它作為觀賞性花卉，又可用它泡酒或熬湯當(dāng)作內(nèi)服，還有的用它做成洗劑和搽劑用作外用。但目前對(duì)“十二時(shí)辰”的藥理藥效研究較少，特別是安全性方面的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。為了有效避免民間應(yīng)用時(shí)可能造成不良反應(yīng)，為保障福建草藥民間的用藥安全。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“十二時(shí)辰”的外用制劑的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)，從而為帶動(dòng)當(dāng)?shù)禺屪宓慕?jīng)濟(jì)和畬醫(yī)畬藥的發(fā)展提供一些理論基礎(chǔ)。