岳倩文 夏 鉑

寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004

脊髓損傷(Spinal cord injury ,SCI)是一種損害患者的脊髓結構及功能，引起運動、感覺以及自主神經(jīng)功能障礙或喪失的疾病。不論是采取手術治療，還是國際通用甲基強的松龍進行沖擊治療，都存在鈉潴留，水腫及尿路感染的風險[1]。烙灸利用溫熱刺激促進受損傷局部氣血運行，加速體液循環(huán)，針對急性病往往有意想不到的作用。烙灸是將烙鐵模具中加艾絨或者其他藥物作用于損傷部位，利用烙鐵作為持續(xù)溫熱刺激傳導于皮膚上，改良了督灸繼發(fā)感染率高的缺點，又給予穴位以持續(xù)溫熱的刺激，從而達到通經(jīng)活絡、消瘀散結之目的。臨床上在血管性癡呆、弱少精子癥、骨與關節(jié)等多種疾病中發(fā)揮著良好療效。本研究主要采用Allen’s打擊模型造成大鼠急性脊髓損傷，較好的模擬了因外力沖擊等外傷所造成的脊髓受損狀態(tài)。通過Wnt、Notch信號通路，通過對脊髓損傷大鼠的Western Blot檢測，分析烙灸療法對脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)修復機制及是否可以促進神經(jīng)干細胞增殖分化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取清潔級SD大鼠60只(寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，6～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，雄性)。溫度(25±l)℃，濕度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由進食和飲水,常規(guī)環(huán)境適應性飼養(yǎng) 14d后進行實驗。

1.2 主要試劑及儀器 甲基強的松龍，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，RIPA裂解液，縫合線、咬骨鉗、一次性注射器、手術剪、組織剪等。Tanon-4200全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)、低溫高速離心機(TGL—16G—A 型，上海安亭科學儀器廠)、超低溫冰箱(MDF—38E2 型，日本三洋公司)、電子恒溫水浴鍋(DZKW-4 型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國 Bio-rad 公司)。

1.3 脊髓損傷模型制備 實驗隨機選取大鼠進行稱重，以100 mg/L水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，置于弓形手術臺，備皮消毒，取后正中線以T10作為中點，依次切開皮膚、筋膜、肌肉，微型咬骨鉗咬合T10段椎板、棘突，暴露脊髓。采用改良的Allen’s打擊裝置，打擊錘重10 g，下落高度為5 cm，致傷量為50 g·cm-1(此致傷量可造成大鼠中等程度脊髓損傷)。當大鼠出現(xiàn)擺尾反應，雙側(cè)后下肢無法移動，硬脊膜內(nèi)充血或水腫，則造模成功。每日兩次進行擠壓膀胱排尿。本實驗嚴格按照動物倫理審查指南進行。

1.4 分組及治療 將60只大鼠按照隨機數(shù)表分為5組，每組12只。A組為假手術組，只做椎管切除，不做任何處理。B組為模型組，在造模成功過后不做治療。C組為甲基強的松龍組，Allen’s打擊30 min后按照30 mg/kg給藥，之后按照5.4 mg/kg給藥，連續(xù)3 d。D組為烙灸2 h組，在脊髓損傷后2 h進行烙灸。E組為烙灸12 h組，在脊髓損傷后12 h進行烙灸。除A組外，各組于Allen’s打擊后腹腔注射2萬μ/kg青霉素，每日1次，連續(xù)3 d，防止創(chuàng)面感染。術后各組予以生理鹽水，連續(xù)3 d。

烙灸操作：在烙灸鐵質(zhì)模具中放置艾絨于D組、E組大鼠脊椎T10-T11段兩側(cè)夾脊穴(脊柱區(qū)，第8胸椎至第十二胸椎棘突下兩側(cè)，后正中線旁開0.5寸處)進行治療(穴位定位參照《實驗動物針灸穴位圖譜》)，每日1次，每次5min，視皮膚發(fā)紅及異常體液排出等狀況而定。

1.5 取材及相關指標檢測

1.5.1 組織取材 各組分別于造模成功后的第1d、7d、14d、21d進行脊髓組織提取，每組在每個時間點取3只，長度為損傷上下1cm，進行Westernblot檢測，觀察脊髓Wnt3a、Wnt1、Hes1、Hes5、β-catenin、Presenilin1的蛋白表達量變化。

1.5.2 Western blot檢測組織研磨、RIPA裂解液進行裂解、勻漿后離心，靜置提蛋白，10%分離膠電泳、轉(zhuǎn)至PAGE膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,孵育一抗：Wnt3a蛋白(1∶1000，Abcam公司)；Wnt1蛋白(1∶1000，Abcam公司)；β-catenin蛋白(1∶5000，Abcam公司)；Hes1蛋白(1∶1000，Abcam公司)；Hes5蛋白(1∶1000，Abcam公司)Presenilin1蛋白(1∶5000，Abcam公司)；GAPDH蛋白(1∶3000，三箭公司)。用漂洗液洗膜3次，孵育二抗 (兔二抗1∶3000，Jackon公司；鼠二抗1∶3000，Jackon公司) 放在化學發(fā)光成像儀中，曝光。

1.6 數(shù)據(jù)處理 利用Image J軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 Wnt信號通路(圖1～圖3) 在Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白檢測中，C、D、E組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從β-catenin檢測中可以看出，各組的蛋白表達量隨著時間的損傷時間的延長均呈現(xiàn)出下降趨勢；但各組蛋白表達量均高于假手術組，表明脊髓損傷后β-catenin表達增強，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在脊髓損傷后被激活。

在術后7 d的檢測中，C組表達量高于B組跟E組；在術后14d檢測中，D組表達量高于B組跟E組。由此可以推斷，2h烙灸治療有助于脊髓損傷大鼠激活β-catenin因子。

圖1 各組大鼠β-catenin蛋白表達比較

圖2 各組大鼠wnt1蛋白表達比較

在Wnt1的蛋白表達量中，D組跟E組呈上升趨勢，B組和C組呈下降趨勢，D組、E組的蛋白表達量低于B組、C組。術后7d檢測中，C組表達高于B組，B組高于E組；在術后14d，D組表達量遠遠低于E組。

在Wnt3a檢測中，模型組蛋白表達量在上升，C、D、E組呈下降趨勢。

在術后7 d檢測中，B組大于E組跟D組；在術后14 d檢測中，B組大于E組跟D組。提示實驗中B組7 d、14dWnt3a蛋白過表達。而在術后21 d檢測中，C組表達量大于D組。D組在第14天較之E組Wnt3a表達量低，提示脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞向損傷區(qū)域遷移，修復受損神經(jīng)元。B組Wnt3a含量最低，提示W(wǎng)nt3a可抑制損傷后炎癥反應，幫助損傷區(qū)域的神經(jīng)干細胞修復。

圖3 各組大鼠wnt3a蛋白表達比較

2.2 Notch信號通路(圖4～圖6) 在Hes1檢測中可以看出，各組的蛋白表達量隨著時間的損傷時間的延長均呈現(xiàn)出下降趨勢。

在術后7d檢測中，C組高于B組、E組，提示增加了星形膠質(zhì)細胞分化的可能性；在術后14d檢測中D組表達量高于B組、E組。E組低表達說明烙灸下調(diào)Notch信號通路來促進其向神經(jīng)干細胞分化。

圖4 各組大鼠Hes1蛋白表達比較

在Hes5檢測中，C、D組蛋白表達量呈下降趨勢，而B組呈上升趨勢，E組術后7d與術后14d表達量相同。

術后7 d檢測中，C組蛋白表達量高于B組跟E組，提示增加了星形膠質(zhì)細胞分化的可能性；術后14 d檢測中，D組表達量高于B組、E組；在術后21 d檢測中，D組高于C組。E組低表達說明烙灸下調(diào)Notch信號通路來促進其向神經(jīng)干細胞分化。

在Presenilin1檢測中，B組、D組呈上升趨勢，C組、E組呈下降趨勢。在術后7 d檢測中，C組表達量高于B組、E組，提示Notch信號通路被激活。在術后14 d檢測中，D組蛋白表達量高于B組、E組，提示激活Notch信號通路受到抑制，D組可能通過抑制Notch信號通路來參與脊髓損傷的神經(jīng)修復。在術后21 d檢測中，D組表達量高于C組。

在Hes1、Hes5、Presenilin1蛋白檢測中，C、D、E組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在Hes1、Hes5、Presenilin1蛋白檢測中，12 h烙灸組明顯優(yōu)于2 h烙灸組。

圖5 各組大鼠Hes5蛋白表達比較

圖6 各組大鼠presenilin1蛋白表達比較

3 討論

3.1 烙灸療法 中醫(yī)學認為脊髓損傷是由于瘀血阻滯督脈，樞機統(tǒng)帥失職，三陽經(jīng)氣血逆亂而致，其病因為“瘀血”，病機為“督脈樞機不利”。沈金鰲在《雜病源流犀燭》謂“脊痛,督脈病也”?；颊哂捎谠柌徽瘢瑲庋徽{(diào)，經(jīng)絡堵塞造成肢體活動不利，烙灸正有此功效，它利用艾絨及器具加熱所產(chǎn)生的溫熱刺激，結合腧穴組織的特點，烙燙皮膚從而激發(fā)人體體液活動稟潛能。在Wnt、Notch信號通路的相關因子檢測中12 h烙灸組的蛋白表達量明顯優(yōu)于2 h烙灸組，提示烙灸作為一種熱效應，不適合在脊髓損傷后立即應用，同時進一步明確烙灸的主要作用為活血化瘀、逐瘀生新、通經(jīng)活絡。

烙灸始載于《回回藥方·針灸門》,“要知灸的得濟處，是凡一體內(nèi)，多有惡潤凝聚以致本體，并其稟性作壞，若人先有之，然亦不能去凈，必以火灸之，則本體病根盡去”[2]。采用補陽還五湯配合烙灸治療腦卒中的臨床病例觀察中發(fā)現(xiàn)患者的神經(jīng)功能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)科基礎治療組[3]。在乳腺增生的疾病治療上根據(jù)月經(jīng)周期以疏肝解郁為治法的中藥其治療效果遠遠低于中藥配合增生局部烙灸組[4]。烙灸正是利用患者病后急需通過大量熱效應和強刺激的手段，增加周圍神經(jīng)的敏感度，加強其與大腦中樞神經(jīng)的聯(lián)系。

3.2 脊髓損傷的Wnt信號通路研究 信號通路被激活后可參與脊髓損傷后神經(jīng)及損傷區(qū)域的修復。Wnt信號通路是目前研究就最多、最透徹的信號通路。Wnt信號通路可以刺激神經(jīng)干細胞的增殖并促使其向神經(jīng)元分化，抑制神經(jīng)干細胞向膠質(zhì)細胞的分化，促進突觸的再生[5]。從術后7 d的蛋白表達量可以看出，在脊髓損傷早期Wnt1被激活后呈現(xiàn)高表達[6]。細胞凋亡、軸突再生、膠質(zhì)瘢痕形成等病理現(xiàn)象是炎癥產(chǎn)生的基礎，DiLiddo[7]研究發(fā)現(xiàn)刺激Wnt3a可明顯改變炎癥因子激活Wnt信號通路抑制炎癥，在SCI的病理過程中起到關鍵作用。Wnt3a雖然可以促進軸突再生，但過表達會抑制神經(jīng)干細胞的增殖而使其過早向分化為神經(jīng)元[8-9]。本實驗中模型組從術后7～14d，Wnt3a表達量不斷上升達到頂峰，提示模型組Wnt3a存在過表達。當Wnt/β-catenin信號通路被激活，可促進神經(jīng)干細胞增殖分化為神經(jīng)元[10]，而本實驗除了假手術組的β-catenin表達量不變，其余各組在損傷后β-catenin蛋白表達升高，術后14天2 h烙灸組的β-catenin表達量最高，表明2h烙灸對脊髓損傷大鼠受損的神經(jīng)干細胞中分化的過程中發(fā)揮主要作用。

3.3 脊髓損傷的Notch信號通路研究 Notch信號通路是神經(jīng)干細胞研究中的一條極為重要的信號通路[11]，通過信號強度影響細胞的分化、增殖和存活。下調(diào)Notch信號通路會促進其向神經(jīng)干細胞分化[12]，激活Notch信號通路有利于神經(jīng)干細胞干性的維持[13]。Hes蛋白通過調(diào)節(jié)控制神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)特異性基因的表達，來調(diào)節(jié)控制神經(jīng)干細胞[14]。Hes1只在神經(jīng)干細胞中表達，其缺失會使神經(jīng)元分化增加[15-16]，其高表達會促進神經(jīng)干細胞的增殖，分化為星形膠質(zhì)細胞抑制神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元[17]。Notch信號表達增強可能是脊髓損傷后限制神經(jīng)功能再生的重要原因， 抑制Notch信號通路活性，可以促進脊髓損傷后功能重建[18]。在Hes1、Hes5及Presenilin1蛋白檢測中，12 h烙灸組在術后7 d、14 d蛋白表達量明顯低于其余各組，證實12 h烙灸治療抑制了Notch信號通路，可促進脊髓損傷功能再生。Nicolas等[19]可知Notch信號在一定條件下具有抑制Wnt信號傳導的作用，因此猜測在Wnt1及Wnt3a蛋白檢測中，脊髓損傷大鼠在經(jīng)過烙灸治療后其蛋白表達量遠低于模型組及甲基強的松龍組，恰恰是Notch通路對Wnt1及Wnt3a的抑制作用。因此Wnt、Notch信號通路相互影響[20]，在脊髓損傷發(fā)生后在進行烙灸后，Wnt、Notch信號通路間的作用及對通路相關因子的作用仍待進一步研究。

綜上，通過檢測脊髓損傷后Wnt、Notch信號通路相關因子的蛋白表達量的變化，發(fā)現(xiàn)烙灸可以通過調(diào)節(jié)Wnt、Notch信號通路，來實現(xiàn)脊髓損傷后對神經(jīng)功能的重建，達到修復受損神經(jīng)干細胞作用，且該療法相較于其他治療費用低，操作簡單，便于臨床推廣。