貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以關節(jié)滑膜炎及自身抗體分泌為特點的慢性自身免疫性疾病[1]，其病因及發(fā)病機制比較復雜。研究認為，炎癥、滑膜增生及骨破壞為RA主要的病理特征，治療時可從抑制炎癥反應、抑制滑膜細胞增殖、抑制軟骨損傷和骨侵蝕幾方面入手[2-3]?；こ衫w維細胞(Fibroblast-Likessynoviocytes，F(xiàn)LS)在RA發(fā)病中起關鍵作用，在病理狀態(tài)下FLS表現(xiàn)為異常增殖及凋亡不足，能分泌高水平促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17，還能分泌化學趨化因子、基質蛋白降解酶等[4]。

苦皮藤CelastrusangulatusMaxim.為衛(wèi)矛科南蛇藤屬苦皮藤的干燥根，具有祛風除濕、活血通經、解毒殺蟲的功效，可治療風濕痹痛、骨折傷痛、瘡瘍潰爛等病[5-6]?？嗥ぬ僦谢瘜W成分豐富，含有倍半萜類、三萜類、二萜類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油等成分[7]。苦皮藤具有殺蟲、殺菌、抗癌等活性，其中殺蟲活性研究較為深入，已有成熟的殺蟲制劑[8]。但關于苦皮藤抗風濕作用的研究在國內外尚無具體報道。根據(jù)文獻記載[9]，苦皮藤配伍藤蘿根、白金條泡酒服用可治療風濕、勞傷、關節(jié)疼痛。由此，為驗證苦皮藤的抗風濕作用，尋找其有效成分及其作用機制，可對苦皮藤進行深入研究。實驗以TNF-α誘導的人類風濕性關節(jié)炎成纖維滑膜細胞模型，研究苦皮藤不同提取部位的抗風濕作用，為篩選苦皮藤抗風濕有效部位及研究其作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株HFLS-RA類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(貨號：JNO-02001)，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物制備 稱取8 mg藥物，充分溶于1mL DMSO中，制成8 mg/mL的母液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，4℃條件下保存。

1.3 試劑 胰酶(+EDTA，批號：J180035，Hyclone)；南美胎牛血清(批號：JC63468，CLARK)；DMEM高糖培養(yǎng)基(批號：WH01111903XP，Procell)；雙抗(批號：J180034，Hyclone)；MTT(批號：EZ2811A179，Biofroxx)；二甲基亞砜(DMSO，批號：SHBJ7919，Sigma)；TNF-α(貨號：300-01A-10，Peprotech)；IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2檢測試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.4 儀器 倒置生物顯微鏡(AE31，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；酶標儀(SpectraMAX Plus384，Molecular Devices)；壓力蒸汽滅菌器(SYQ-DSX-280B，上海宜川儀表廠)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-15AC，三洋電機國際貿易有限公司)；臺式低速離心機(TDZ4-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測苦皮藤對HFLS-RA增殖活性的影響 取對數(shù)生長期的HFLS-RA細胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液，調節(jié)細胞密度3.5×104/mL，200 μL/孔接種于96孔板中，每種藥物分別設置空白對照組、160、80、40、20、10 μg/mL組，每組5重復，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入對應藥物。待藥物分別作用24、48、72 h后，吸棄上清，每孔加入200 μL終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄液體，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，用酶標儀測定其在490 nm處的吸光度(OD)值，計算細胞的生存率。

2.2 ELISA法檢測TNF-α誘導的HFLS-RA中相關細胞因子的表達 取對數(shù)生長期的HFLS-RA細胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化收集，1000 rpm離心5 min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細胞懸液，調節(jié)細胞密度7×104/mL，2 mL/孔接種于24孔板中，24 h細胞貼壁后棄去上清液，設置空白組、模型組、樣品組，每組3重復?？瞻捉M不加藥物及TNF-α，模型組用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)預處理1 h后，加入1 mL 20 ng/mL的TNF-α，樣品組分別加入質量濃度為10、40、160 μg/mL的7種不同藥物1 mL，預處理1 h后，再加入1 mL TNF-α，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，72 h后收集上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的含量。

3 結果

3.1 苦皮藤對HFLS-RA增殖的影響 采用MTT法測定OD值，通過公式計算細胞活力可以看出，TNF-α誘導組細胞活力最高，可以促進HFLS-RA增殖。結果表明，隨著干預時間的延長，各組OD值降低，抑制率逐步升高，呈時間和劑量依賴性。藥物干預24 h，與空白組比較，A、C組(10 μg/mL)，B、E組(10，20，40 μg/mL)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。A、E、F、G組對細胞增殖無明顯抑制作用，且在較低濃度時對細胞增殖有促進作用；C、D組在高劑量下對細胞增殖有一定抑制作用(見圖2)。

藥物干預48 h，與空白組比較，A、B、G組(10，20 μg/mL)，F(xiàn)組(10，20，40 μg/mL)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。C、D組可明顯抑制HFLS-RA的增殖(見圖3)。

藥物干預72 h，與空白組比較，A、E組(10 μg/mL)，F(xiàn)組(10，20，40 μg/mL)，G組(10，20 μg/mL)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。各組隨著給藥濃度增加，對細胞增殖均出現(xiàn)不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴性，其中C、D組(160 μg/mL)對HFLS-RA的增殖有明顯抑制作用(見圖4)。石油醚部位作用24 h、48 h、72 h的IC50值分別為156.38、75.044、61.347 μg/mL，二氯甲烷部位作用48 h、72 h的IC50值分別為94.571、63.513 μg/mL，其余部位無法獲取IC50。在ELISA實驗中采用高、中、低(160、40、10μg/mL)3個劑量來考察苦皮藤各個部位對相關細胞因子的影響。

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 苦皮藤各個提取部位作用24h對細胞活力的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 不同濃度的苦皮藤各個提取部位作用48h對細胞活力的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 不同濃度的苦皮藤各個提取部位作用72h對細胞活力的影響

3.2 苦皮藤對HFLS-RA分泌細胞因子的影響

3.2.1 苦皮藤對IL-1β的影響 由表1可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中IL-1β含量極顯著升高(P<0.01)。與TNF-α組比較，B、C、D組(40，160μg/mL)中IL-1β含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且各組對IL-1β的作用呈一定的濃度依賴關系；E組(160μg/mL)中IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)。

3.2.2 苦皮藤對IL-6的影響 由表2可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中IL-6含量極顯著升高(P<0.01)。與TNF-α組比較，C組(40，160 μg/mL)中IL-6含量均明顯降低(P<0.05)，呈一定的濃度依賴關系；D組(160μg/mL)中IL-6含量顯著降低(P<0.05)。

表1 苦皮藤不同提取部位對TNF-α誘導的HFLS-RA中IL-1β含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01。

表2 苦皮藤不同提取部位對TNF-α誘導的HFLS-RA中IL-6含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；其余組與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2.3 苦皮藤對MMP-3的影響 由表3可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中MMP-3含量極顯著升高(P<0.01)。與TNF-α組比較，C、D組(160 μg/mL)中MMP-3含量均明顯降低(P<0.05)。

3.2.4 苦皮藤對PGE2的影響 由表4可知，與空白組比較，TNF-α組細胞上清中PGE2含量極顯著升高(P<0.01)。與TNF-α組比較，C組(40，160 μg/mL)中PGE2含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，呈一定的濃度依賴關系；A、B、D組(160 μg/mL)中PGE2含量均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 苦皮藤不同提取部位對TNF-α誘導的HFLS-RA中MMP-3含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01。

表4 苦皮藤不同提取部位對TNF-α誘導的HFLS-RA中PGE2含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

研究認為，滑膜成纖維細胞(FLS)在炎癥反應的發(fā)展和關節(jié)破壞過程中起著重要作用，能直接破壞軟骨和骨組織，是治療RA的重要靶點[10]。FLS可合成并分泌腫瘤細胞因子、白細胞介素、干擾素、趨化因子、集落刺激因子、生長因子等多種因子，如IL-6、IL-8、PGE2、膠原酶、基質金屬蛋白酶等，這些炎癥介質均參與滑膜炎癥反應并最終導致關節(jié)破壞[11]。本實驗通過研究苦皮藤對HFLS-RA細胞增殖及分泌炎癥因子的抑制能力，初步分析苦皮藤抗風濕有效部位及可能機制。

MTT法檢測苦皮藤對細胞增殖活性的影響實驗表明，隨著時間延長及給藥濃度增加，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余層部位對細胞的增殖均無明顯抑制作用；石油醚部位與二氯甲烷部位對細胞的抑制率逐步升高，呈時間和劑量依賴性，當給藥濃度為160 μg/mL，干預72 h時抑制率最高，抑制效果最佳，抑制率分別達到90.701%、91.318%。ELISA法檢測苦皮藤對細胞分泌炎癥因子含量的影響實驗表明，TNF-α可誘導HFLS-RA分泌高水平的IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2，體現(xiàn)其促炎功能。石油醚部位及二氯甲烷部位(160 μg/mL)能顯著抑制相關細胞因子的表達(P<0.05，P<0.01)，提示這兩個部位可能通過抑制HFLS-RA分泌細胞因子，從而減少炎癥因子的產生與釋放；其余部位均沒有明顯的抑制作用。綜上，苦皮藤中具有抑制HFLS-RA增殖及其分泌炎癥因子能力的有效成分集中在石油醚部位及二氯甲烷部位。

苦皮藤中富含萜類成分，主要集中在小極性部位[12]。研究表明，萜類成分具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節(jié)等廣泛的生物活性[13-14]。其中倍半萜類化合物可通過抑制NF-κB，MAPKs和STAT等信號通路相關因子的活化，下調TNF-α、PGE2、NO、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子的蛋白表達，實現(xiàn)抗炎作用[15]。由此推測苦皮藤抗風濕作用可能與萜類成分相關，尚待進一步實驗驗證。

綜上所述，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余層部位對細胞增殖及相關細胞因子的表達均無明顯抑制作用；石油醚部位與二氯甲烷部位可抑制HFLS-RA的異常增殖，并能夠顯著降低IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的表達水平，為下一步探究苦皮藤抗風濕有效成分及其作用機制奠定基礎。