李俊秀 廖夏云,2 趙立春,2﹡ 楊濤,2

1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200

青錢柳[Cyclocaryapaliurus(Bata1.) Iljinskaja ] 別名青錢李、麻柳、搖錢樹、山化樹、一串錢、山麻柳、甜茶樹等，系胡桃科、青錢柳屬植物[1]。分布于我國南方多省地海拔420～2500m的山區(qū)、溪谷、石灰?guī)r山地[2]。《中國中藥資源志要》中記載：青錢柳葉和皮均可入藥，具有止痛、清熱解毒等功效，用于治療頑癬[3]。高血糖癥現(xiàn)已成為人類的第二大殺手，而由青錢柳芽葉制成的茶在“三高癥”人群的防治中有良好效果。青錢柳茶也成為我國首個被美國FDA認證的抗高血糖保健茶[4]。研究者對青錢柳化學成分進行提取、分離和純化發(fā)現(xiàn)：青錢柳提取物除含豐富的礦質(zhì)元素外，其化學成分主要有黃酮類、多糖、甾體類、內(nèi)酯、皂苷、氨基酸等，尤以黃酮類化合物含量較為豐富[5-7]。動物實驗及臨床實驗研究表明：青錢柳提取物有多種保健功能，能降血糖、降血壓、降血脂、增強細胞免疫、抗氧化、防衰老、抗癌等[8-13]。黃酮化合物在青錢柳提取物藥效成分中占一定比例。植物黃酮的諸多功效應用在食品、化妝品、醫(yī)藥等領域有其獨特的優(yōu)勢，因此，對黃酮類化合物的研究對于青錢柳藥用價值的開發(fā)和利用具有重要意義。筆者通過檢索相關文獻資料，綜述青錢柳黃酮的成分組成、測定方法、提取方法以及活性研究進展，為青錢柳黃酮的進一步研究及開發(fā)應用提供參考依據(jù)。

1 青錢柳黃酮類化學成分

黃酮類化合物是青錢柳的主要化學和活性成分之一。研究者利用各種色譜技術對青錢柳化學成分分離和純化，并通過物理化學和波譜等鑒定技術手段，目前已鑒定并報道的青錢柳黃酮單體達40多種，主要為黃酮醇及其苷類結構，與苷元結合的糖有葡萄糖、甘露糖和鼠李糖等。結果見表1、圖1。

表1 已鑒定的青錢柳黃酮單體

圖1 化合物1～46的結構

2 青錢柳黃酮類成分的測定

2.1 紫外可見分光光度法 黃酮類化合物因結構中有A環(huán)(苯甲?；到y(tǒng))和B環(huán)(桂皮?；到y(tǒng))兩個交叉共軛體系，分別在240～280 nm(帶Ⅰ)和300～400 nm(帶Ⅱ)之間產(chǎn)生兩個紫外吸收譜帶。因黃酮苯環(huán)上多有取代酚羥基，堿性條件下兩個紫外吸收譜帶可出現(xiàn)紅移。利用此光譜性質(zhì)，采用分光光度法在其紫外波譜的λmax處可測定總黃酮含量。目前文獻報道的運用紫外分光 光度法測定青錢柳總黃酮含量，多以蘆丁為對照品，以三氯化鋁為顯色劑[28-29]，或以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系為顯色劑[30]，顯色后用分光光度計在一定波長處測定。值得注意的是，一些黃酮類化合物(異黃酮、黃烷酮、兒茶素等)在可見光區(qū)與AlCl3作用不顯色可能導致測定結果偏??；而以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色體系時，在500nm波長處某些黃酮類成分(黃芩素、橙皮苷、槲皮素、山奈酚等)吸收很弱，但某些非黃酮類成分(綠原酸、原兒茶酸等)有最大吸收，使硝酸鋁顯色法專屬性不強，準確性較差。李富民等[31]曾以蘆丁和槲皮素為對照品，對三氯化鋁顯色法(測定波長410 nm)和硝酸鋁顯色法(測定波長500nm)進行反復試驗比較，結果得出AlCl3顯色法是比Al(NO3)3顯色法更精確、快速的含量測定方法，更適合于青錢柳總黃酮含量測定的結論。

2.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法(HPLC)具有分離效果好、專屬性強、重復性好、準確度高、分離分析速度快、儀器自動化程度高等特點，廣泛應用于天然產(chǎn)物尤其是單體化合物的含量分析。將樣品溶液注入HPLC系統(tǒng)進行在線分離和檢測，利用外標法、內(nèi)標法、面積歸一化法等方法，測定指標成分的含量。對多組分的含量測定則需利用校正因子或轉換系數(shù)進行數(shù)據(jù)處理，換算出樣品中總黃酮的含量。表2列出了近年利用HPLC法分析青錢柳黃酮含量的相關研究，可見HPLC法為測定青錢柳黃酮成分含量、建立青錢柳指紋圖譜、篩選藥用青錢柳優(yōu)良產(chǎn)地、確定青錢柳的最佳采收期，對青錢柳進行質(zhì)量評價和控制等提供了快速、可靠的分析手段。

表2 HPLC法分析青錢柳黃酮的相關研究

續(xù)表2 表2 HPLC法分析青錢柳黃酮的相關研究

3 青錢柳黃酮類成分的提取

3.1 溶劑提取法 溶劑提取法中水提法適用親水性黃酮類化合物，如水溶性黃酮苷類的提取。因水提法的提取效率低、提取物中極性雜質(zhì)多、分離提純困難而不常用。堿提取酸沉淀法應用在含弱酸性酚羥基的黃酮類化合物的提取上比起醇提法更具安全、便捷、成本低等優(yōu)勢，其提取基本流程：青錢柳樣品→加入適量硼砂、堿性飽和石灰水提取→提取液PH值調(diào)至酸性→提取液加入乙酸乙酯、正丁醇分別萃取→萃取液合并，旋轉蒸干→青錢柳總黃酮。得率與固液比、堿提取液PH值、硼砂用量、提取時間、酸沉PH值等因素有關，可采用正交實驗設計優(yōu)化影響因素的工藝參數(shù)[36]。

有機溶劑提取法是提取黃酮類成分的經(jīng)典方法，比較容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，常用的有機溶劑為乙醇。鄧佑林等[37]采用索氏提取器加熱回流提取青錢柳總黃酮，比較了不同濃度乙醇和水為溶劑下的提取效果，結果以水為溶劑時提到的黃酮含量只有乙醇的一半，證明乙醇對青錢柳黃酮的溶出效率高。乙醇提取具有無毒、提高黃酮類成分溶解性等優(yōu)點，但提取時間長、溶劑耗量較大、提取液需進一步處理。

3.2 超聲輔助提取法 超聲輔助提取具有操作簡單，耗能少，提取效率高等優(yōu)點，其應用是建立在溶劑提取的基礎上，因超聲波可加快青錢柳細胞壁的破裂，減少提取時間，從而提高黃酮提取效率；同時該方法提取時不需要較高的溫度，可避免黃酮類化合物結構遭到破壞，被廣泛應用。作為一種常用的中藥活性成分提取方法，超聲功率、超聲時間、超聲溫度、提取溶劑、用量等均能影響青錢柳總黃酮提取率，不同因素對其提取率的影響作用大小不盡相同。吳茹[38]采用響應面法優(yōu)化了影響乙醇超聲提取青錢柳總黃酮的各因素工藝參數(shù)，得到提取率的影響因素作用大小依次為：超聲功率、乙醇濃度、提取時間、料液比。優(yōu)化的工藝參數(shù)為：乙醇濃度48%；料液比1∶34g·mL-1；超聲功率162W；超聲時間41min。該條件下提取率達8.427%。

3.3 微波輔助提取法 微波提取法是利用微波能量加快藥物分子熱運動，從而加速破壞細胞壁使有效成分更快提取出來的方法。楊武英等[39]研究了微波輔助法提取青錢柳葉總黃酮，數(shù)據(jù)分析表明，微波功率是影響微波輔助提取青錢柳葉總黃酮得率的最主要因素。最佳提取工藝參數(shù)為：40%乙醇；料液比1∶40g·mL；微波功率2100W；提取時間25min。此條件下，青錢柳葉總黃酮提取率為5.60%。微波法作前處理，比一般方法溶劑耗量少，時間短，得率高。

3.4 酶解法 利用酶對大分子物質(zhì)的分解作用，在原料中加入合適的酶使細胞壁和間質(zhì)中的纖維素、果膠等大分子物質(zhì)完全分解，黃酮物質(zhì)被充分釋放出來后，再對其進行提取，能大大提高提取效率?？赂Ｐ荹40]采用酶法-超聲波輔助提取青錢柳葉中總黃酮，根據(jù)單因素試驗和正交試驗數(shù)據(jù)分析，得出最佳提取工藝為：0.4g.100mL-1的木瓜蛋白酶水溶液作為提取劑；溫度58℃；超聲波功率400W；提取時間70min。柳旭光等[41]以纖維素酶解法提取青錢柳黃酮，運用響應面法優(yōu)化影響因素參數(shù)，在酶解時間32.28min；溫度41℃；加酶量0.57%；緩沖液pH 6.37的條件下提取效率最佳，青錢柳總黃酮提取得率達9.227%。酶法與別的提取方法聯(lián)用，提取量顯著高且活性成分保存好。

3.5 其他提取方法 深共晶溶劑是一種新型的離子溶劑，具有低廉、易合成、安全性高、環(huán)保等優(yōu)點。其顯著的物理化學和生物降解性能使它們成為傳統(tǒng)有機溶劑的替代品。ShangXC等[42]研究超聲輔助-深共晶溶劑萃取法(UAE-DES)提取青錢柳葉中黃酮類化合物，試驗了九種基于兩種或三種組分的DES體系，篩選出合適青錢柳黃酮化合物提取的工藝，DES可作為生物活性化合物的可持續(xù)提取介質(zhì)，該法是一種較好的從青錢柳葉中選擇性提取黃酮類化合物的方法。

微生物發(fā)酵技術是利用微生物生長過程中產(chǎn)生的代謝物酶，分解破環(huán)植物細胞組織結構，使有效成分較大程度的溶出，該法具有提取物穩(wěn)定、純度高、反應條件溫和、有機溶劑使用量少等優(yōu)點。將微生物發(fā)酵技術應用到青錢柳黃酮提取(工藝流程：青錢柳葉干燥、粉碎→酶解→高溫滅菌→接種→發(fā)酵提取→過濾→青錢柳黃酮)，得率遠高于超聲提取和有機溶劑提取[43]，是一種經(jīng)濟有效、快速提取的方法，大大提高青錢柳黃酮的提取率和原料利用率。

將近幾年選擇不同提取方法得到的青錢柳黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝條件列于表3。由于原料的產(chǎn)地、處理方法的不同，各提取方法提取的青錢柳黃酮得率存在一定差異，提取方法的優(yōu)越性僅根據(jù)黃酮得率高低來判斷意義不大，還應從黃酮的純度和活性方面綜合考慮，建議根據(jù)研究的目的、要求、條件及環(huán)境選擇適宜的提取方法。

表3 青錢柳總黃酮不同提取方法研究

4 青錢柳黃酮類成分活性研究

黃酮類化合物是青錢柳的 主要活性成分之一。對青錢柳黃酮生理活性及作用的研究如下(表4)。

4.1 降血糖 糖尿病治療機制主要有促進胰島素分泌、增加胰島素敏感性、減輕胰島素抵抗、抑制α糖苷酶等，青錢柳黃酮降血糖機理的研究也主要從調(diào)節(jié)血糖水平、改善胰島細胞功能、改善胰島素抵抗和免疫調(diào)節(jié)等方面進行。

鏈脲佐菌素對胰島β細胞有選擇性破壞作用，導致胰島素分泌不足。對鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病大鼠用青錢柳總黃酮連續(xù)給藥，可降低糖尿病大鼠空腹血糖、提高血胰島素水平、減緩體重下降，并且能改善其肝腎功能，推測降血糖的原因可能是糖尿病大鼠中殘存的胰島細胞被青錢柳總黃酮成分激活有關[46]。前脂肪細胞分化能使多種相關轉錄因子的表達發(fā)生變化，促進細胞對葡萄糖的攝取和利用，提高脂肪組織細胞的敏感性；HepG2細胞具有表達胰島素樣生長因子和胰島素受體的代謝反應。它們對胰島素抵抗是引起糖脂代謝紊亂的重要原因。對3T3-L1前脂肪細胞胰島素抵抗模型和HepG2細胞胰島素抵抗模型的研究結果表明：青錢柳總黃酮能明顯促進3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化，改善胰島素抵抗作用，提高胰島素抵抗的脂肪細胞和HepG2細胞葡萄糖攝取量[47-48]。通過體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗，揭示青錢柳黃酮成分的降血糖機制還與抑制α-葡萄糖苷酶活性，延緩餐后血糖升高有關[49]。

4.3 抗菌活性 黃酮類化合物屬于酚類衍生物，pH偏酸性，能讓菌類蛋白質(zhì)凝固或變性，使其細胞壁及細胞膜被破壞，導致微生物產(chǎn)生功能性障礙，生長被抑制或菌體死亡。體外抗菌實驗常用方法有稀釋法、濾紙片法、打洞法、管蝶法等，濾紙片法操作簡單、結果直觀、重復性好、成本低，是最常用的方法。采用濾紙片擴散法研究青錢柳黃酮對常見的腐敗菌種(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌等)的抑菌效果，通過測定抑菌圈的各項指標，馮宗帥[50]的研究結果顯示對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度MIC和最低殺菌濃度MBC分別為25 mg/mL、28 mg/mL；37 mg/mL、40 mg/mL和40 mg/mL、40 mg/mL。Lei X等[32]的實驗研究顯示青錢柳黃酮濃度高于40 mg/mL時，抑菌和殺菌效果好，純化后的青錢柳葉總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑制能力最強，其次是沙門氏菌，對大腸桿菌的抑制能力最弱。

4.4 抗急性肝損傷 肝損傷是各種肝臟疾病共同的病理環(huán)節(jié)，急性肝損傷(ALF)的特征是突然出現(xiàn)肝功能障礙、凝血障礙和腦病。目前已知多種外源性藥物可引起肝毒性和急性肝衰竭，四氯化碳(CCl4)和D-半乳糖胺(D-GalN)是常用的誘發(fā)化學性肝損傷模型的化學藥物，模型病理特征穩(wěn)定可靠，在病理學改變與生物化學變化方面與人化學性肝損傷相似。Xie JH等[51]對四氯化碳導致的小鼠急性肝損傷進行了研究，發(fā)現(xiàn)用青錢柳黃酮處理能較好地降低ALF小鼠血清ALT和AST水平(P<0.01)，同時降低肝勻漿中丙二醛(MDA)的含量，顯著升高超氧化物歧化酶(SOD)活力和總抗氧化能力(T-AOC)。對脂多糖和D-半乳糖胺((LPS/D-GalN)聯(lián)合誘導的急性肝衰竭小鼠給予青錢柳黃酮處理(100 mg / kg、200 mg / kg、400 mg / kg)，均能有效提高ALF小鼠的存活率[52]，青錢柳黃酮通過抑制ALT和AST水平，減輕氧化應激，改善肝形態(tài)，降低小鼠肝細胞凋亡，有效預防和治療CCl4和D-GalN誘導的ALF。

4.5 調(diào)節(jié)腸道微生物 黃酮類化合物生物利用度較低，青錢柳總黃酮口服后大部分留在大腸內(nèi)累積，對腸道微生物具有調(diào)控作用，影響某些代謝途徑，對某些疾病具有潛在的治療作用，有助于改善人類健康。肥胖是一個嚴重的全球性健康問題，是許多危及生命的疾病發(fā)生或發(fā)展的危險因素，肥胖人群中厚壁菌門與擬桿菌門的比例(F/B)高于瘦人，通過對高脂飲食(HFD)誘導的肥胖小鼠給予青錢柳總黃酮(CPF)治療8周后，發(fā)現(xiàn)HFD組體重明顯大于HFD-CPF組，F(xiàn)/B值有明顯下降(P<0.05)，表明青錢柳黃酮對高脂飲食誘導的肥胖具有調(diào)節(jié)保護作用[53]。此外，通過體外厭氧糞樣混合培養(yǎng)實驗研究[54]，青錢柳黃酮能改變腸道內(nèi)菌體的組成，增加有益菌群雙歧桿菌、乳酸菌的繁殖，并抑制擬桿菌、梭狀菌的生長，而對總體菌群數(shù)量基本沒有影響。青錢柳黃酮具有益生元活性，可能與其發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝活動中產(chǎn)生的氧化應激的抗氧化作用，從而為腸道有益菌群提供了更有利的生長和繁殖環(huán)境有關。

表4 青錢柳黃酮的生物活性

續(xù)表4 表4 青錢柳黃酮的生物活性

5 總結與展望

青錢柳在治療“三高癥”、抗氧化等方面有顯著的效果，具有很高的開發(fā)利用價值。由青錢柳葉加工成的茶具有良好的保健功效被廣泛認可，同其他品種茶葉相比，青錢柳葉中黃酮類成分的含量較高。目前，研究者對青錢柳化學成分的提取分離及活性研究方面已取得不錯的進展，對青錢柳的進一步深入研究、原材料質(zhì)量評價、相關產(chǎn)品開發(fā)及資源合理利用等方面提供了豐富的理論依據(jù)。但關于青錢柳黃酮類成分的研究仍不足：

①關于青錢柳黃酮提取的研究較多，而純化方面的研究較少，且研究不夠系統(tǒng)，僅停留在實驗階段，今后可學習借鑒其他天然產(chǎn)物中黃酮的提取純化技術，創(chuàng)新其提取純化工藝，以達到高效、快速、低成本、利于規(guī)?；a(chǎn)的目的。

②目前在青錢柳黃酮類成分藥理活性和作用機制的研究方面，多是對其總提取物和總成分進行研究，而對單體尤其是新分離出的單體化合物的研究不足，應進一步深入開展單體的藥效和構效關系的研究，以便闡明青錢柳黃酮發(fā)揮藥理作用的具體成分和作用機理。

③青錢柳黃酮類化合物主要以糖苷的形式存在，不同黃酮母核與糖元結合的種類、數(shù)量、結合位點和方式都可能影響其藥理活性；另外，青錢柳黃酮類單體成分仍有很多沒有被分離鑒定出來，故在未來的研究中，應加速青錢柳黃酮單體的精細分離和結構解析，并根據(jù)其結構特點進行分類匯總、對比活性研究，對不斷闡明和挖掘其潛在的構效關系，尋找具有針對性和高效性的黃酮類先導化合物以及進行結構改造和優(yōu)化均有重要意義。

④青錢柳黃酮類成分含量較高，但目前已開發(fā)的產(chǎn)品在市場上僅以茶葉、飼料為主，青錢柳黃酮的諸多功效未能得到充分開發(fā)和利用，相信隨著研究的不斷深入推進，更多療效明確的青錢柳黃酮保健產(chǎn)品和藥品將被開發(fā)出來，在發(fā)展人民的健康事業(yè)和發(fā)展地方經(jīng)濟上青錢柳有廣闊的前景。