荀秀彪 張順平

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

龍金通淋膠囊由龍膽、魚腥草、白花蛇舌草、金錢草、梔子、茯苓等12味藥組成，具有清熱利濕、化瘀通淋的功效，臨床用于濕熱瘀阻所致的淋證、尿急、尿頻、尿痛、前列腺炎、前列腺增生見上述證候者[1]。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2](WS-10375(ZD-0375)-2002-2012Z)中龍膽苦苷含量測定方法為高效液相色譜法。該實驗根據(jù)相關(guān)文獻及資料[3-5]，對高效液相色譜法測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度進行分析，初步建立適用于高效液相色譜法(HPLC)測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度評定方法，消除在檢驗過程中可能帶來的誤差，以控制測定結(jié)果的有效性和適宜性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津LC-20A型高效液相色譜儀(四元泵，自動進樣器，柱溫箱， 紫外檢測器)；KQ-300UDB型雙頻數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS205DU電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；PURELAB Flex 3一體式超純水儀(英國ELGA公司)。

1.2 藥品與試劑 龍金通淋膠囊(批號：190503，云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.46 g/粒，)；龍膽苦苷對照品(批號：110770-201918，含量為97.1%，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(22∶78)為流動相；檢測波長為274 nm；柱溫35 ℃。理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計算不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取市售的龍金通淋膠囊裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，混勻，取0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率150 W，頻率55 Hz)，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄出濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 uL，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結(jié)果見表1，色譜圖如圖1所示。

表1 峰面積測定結(jié)果

3 結(jié)果分析

3.1 數(shù)字模型 按照《中國藥典》2015版二部規(guī)定，含量計算公式：

公式中Y為每粒中龍膽苦苷的含量(mg粒)；A供為供試品溶液峰面積；W對為對照品稱樣量(mg)；P對為對照品純度；V供為供試品溶液的稀釋倍數(shù)；W平均裝量供試品的平均裝量(g)；A對為對照品溶液峰面積；W供為供試品稱樣量(g)；V對為對照品溶液的稀釋倍數(shù)。

3.2 不確定度的來源分析 從公式中可以看出龍膽苦苷的含量測定不確定度主要來源于供試品溶液峰面積；供試品稱樣量；供試品溶液的稀釋倍數(shù)；供試品的平均裝量；對照品純度；對照品稱樣量；對照品溶液峰面積；對照品溶液的稀釋倍數(shù)以及高效液相色譜儀測量帶來的不確定度。

3.3 各分量不確定度的量化評定

3.3.4 對照品峰面積引入的相對不確定度urel(AR) 樣品在測試過程中受進樣體積重復(fù)性、泵流速的穩(wěn)定性、分離的重復(fù)性、組分在色譜柱滯留變化、檢測器的穩(wěn)定性、積分變動性等隨機變化的影響，可合并為進樣重復(fù)性進行測量[7]，屬于A類不確定度。對照品1重復(fù)進樣5次，峰面積為534.5、534.2、537.6、535.8、535.3，平均值為535.5，對照品1峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

則對照品峰面積引入的相對不確定度：

3.3.5 供試品稱量引起的相對不確定度urel(WX) 此不確定度的分析同3.3.2項。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(WX)=1.30×10-1mg。兩份供試品稱樣量為605.23 mg和602.25 mg，其相對不確定度為：

=2.80×10-2，其相對不確定度：urel(Vx)=2.80×10-250=5.60×10-4。

3.3.9 高效液相色譜儀測量引入的不確定度urel(HPLC) 高效液相色譜儀測量引入的不確定度[12]由計量檢定機構(gòu)檢定校準(zhǔn)得來，日本島津LC-20A型高效液相色譜儀檢定證書(證書編號：918028710)給出的相對不確定度為0.002。

3.4 合成相對不確定度 不確定度各分量分析結(jié)果[13],見表2。

表2 不確定度各分量的相對不確定度

將表1中不確定度分量合成，得到含量測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

因測得每粒中龍膽苦苷的含量Y=4.57(mg粒)，則合成相對不確定度uc(Y)=1.93×10-2×4.57=0.088 mg。

3.5 擴展不確定度U 測量結(jié)果符合正態(tài)分布，取置信概率為95%，包含因子k=2，則U=k×uc(Y)=2×0.088=0.18 mg，含量測定結(jié)果可以表示為：Y=(4.57±0.18)mg(k=2，置信概率為95%)。

4 討論

雖然一切測量結(jié)果都不可避免具有誤差，且由于測量誤差的存在，需要對被測量值的不能肯定的程度和結(jié)果的可信賴程度進行評定，即不確定度的評定。不確定度越小，測結(jié)果與被測量的真值愈接近，質(zhì)量越高，水平越高，其使用價值越高；不確定度越大，測量結(jié)果的質(zhì)量越低，水平越低，其使用價值也越低。不確定度是測量結(jié)果質(zhì)量的重要參數(shù)指標(biāo)。在報告物理量測量的結(jié)果時，必須給出相應(yīng)的不確定度，一方面便于使用它評定其可靠性，另一方面增強測量結(jié)果之間的可比性。因此測量不確定度評定成為檢測和校準(zhǔn)實驗室必不可少的工作之一，使用“不確定度”代替“誤差”更為科學(xué)。因此，不確定度在測量領(lǐng)域內(nèi)越來越受到社會重視，被廣泛應(yīng)用。

通過對龍膽苦苷含量測定的不確定度來源進行分析，列出了檢測過程中各影響因素，雖然高效液相色譜法中高效液相色譜儀本身對測量結(jié)果的影響因素就很多[14]，但可以盡量減少影響主要來自于對照品稱量的相對不確定度[15]，同時按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行檢驗，減少不必要的稀釋步驟，嚴(yán)格控制實驗環(huán)境和條件，定期做好天平、液相色譜儀、玻璃儀器的校驗工作，盡量減少不確定度的影響因素，進而提高含量測定結(jié)果的質(zhì)量。