汪 泓 陽 霞 張紅雁

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。手術(shù)切除是根治肝癌的重要手段，但患者預(yù)后差異很大[2]。對肝癌患者預(yù)后精準評估，可為治療方案的選擇提供依據(jù)，從而延長其生存期。目前，尚缺乏反映肝癌分子生物學特征的預(yù)后因子，臨床常用的肝癌預(yù)后分期系統(tǒng)的準確性有待提高[3-4]。 研究[5-6]表明，從TCGA數(shù)據(jù)庫中可獲取腫瘤組織的反相蛋白質(zhì)陣列(reverse-phase protein arrays，RPPA)，利用高通量的生物信息學篩選方法有助于精準找尋和成功鑒定肝癌預(yù)后分子標志物以評估患者預(yù)后[7]。決策樹分析方法已在預(yù)測惡性胸膜間皮瘤、重癥急性胰腺炎、急性肝功能衰竭等疾病的預(yù)后中表現(xiàn)出良好的風險分層特性[8-12]。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫 HCC RPPA數(shù)據(jù)，選擇預(yù)后蛋白標志物Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf用于775例肝癌患者組織免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色，聯(lián)合患者臨床病理信息，采用決策樹方法構(gòu)建肝癌預(yù)后模型并驗證，為臨床判定肝癌患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集1998年1月至2010年12月中山大學腫瘤防治中心775 例HCC患者石蠟包埋病理標本。納入標準：所有病例均病理確診為肝細胞癌；均為根治性肝癌切除患者，且術(shù)前或術(shù)后未進行抗腫瘤治療；患者臨床病理資料齊全、隨訪數(shù)據(jù)完整。臨床病理資料包括年齡、性別、肝炎病史、血清甲胎蛋白、肝硬化情況、腫瘤數(shù)目、大小、分化程度、分期和血管浸潤程度等。腫瘤分化程度根據(jù)Edmonson等[13]診斷標準鑒定。TNM分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會的分類定義[14]。隨訪時間：第1年每3個月隨訪1次，隨后2年每6個月隨訪1次，此后每年隨訪1次。隨訪觀察總生存時間(overall survival，OS)和無病生存時間(disease-free survival time，DFS)。OS定義為從肝癌手術(shù)至患者死亡，或最后一次隨訪的間隔時間。DFS定義為從肝癌手術(shù)到腫瘤復(fù)發(fā)的間隔時間。腫瘤復(fù)發(fā)(包括肝內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移)需通過超聲、CT或MRI鑒定。最后一次隨訪存活的患者或未診斷出腫瘤復(fù)發(fā)的患者，以及其他原因?qū)е禄颊咚劳霰灰暈閯h失數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 篩選肝癌預(yù)后蛋白標志物 從TCGA數(shù)據(jù)庫獲得182例肝癌患者的RPPA數(shù)據(jù)、臨床病理及預(yù)后信息。利用Cox比例風險回歸模型進行單因素生存分析，計算風險比(hazard ratio，HR)及95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，將差異有統(tǒng)計學意義的預(yù)后相關(guān)蛋白納入LASSO回歸分析，篩選出影響肝癌預(yù)后的關(guān)鍵蛋白標志物。構(gòu)建LASSO邏輯回歸使用R軟件(版本3.4.3)和“ glmnet ”軟件包[15]。

1.2.2 肝癌組織預(yù)后蛋白標志物IHC染色及評估 將福爾馬林固定、石蠟包埋的病理組織塊和相應(yīng)的HE染色玻片比對以進行組織微陣列(Tissue microarray，TMA)采樣。由病理科具有高級職稱的醫(yī)師閱片并標記癌旁肝組織和肝癌組織區(qū)域。將組織重新嵌入新的石蠟塊中，4 μm切片并進行后續(xù)IHC染色[16]。兔單克隆抗TUBA1B抗體(ab108629，Abcam)以1∶1 500稀釋。兔單克隆抗B-raf 抗體(ab33899，Abcam)和兔多克隆抗PAI-1抗體(AF5176，Affinity Biosciences)的稀釋度均為1∶200 。

從0～12分對IHC染色強度和比例進行評分[17]。染色強度等級：0分，IHC無染色；1分，染色弱；2分，染色適中；3分，染色強。染色比例：0分，沒有檢測到陽性染色細胞；1分，<25%的細胞染色；2分，25%～50%的細胞染色；3分，50%～75%的細胞染色；4分，>75%的細胞染色。IHC分數(shù)是通過強度和比例相乘來計算。根據(jù)2位病理科醫(yī)師評分結(jié)果的平均值確定最終IHC得分。

1.2.3 肝癌患者預(yù)后決策樹模型的構(gòu)建及驗證

1.2.3.1 分組 通過計算機生成的隨機數(shù)將775例肝癌患者分為訓練隊列544例和驗證隊列231例。訓練隊列中，男性489例，女性55例；年齡13～77歲，平均(49.1±11.9)歲，隨訪0.1～117.1 個月，中位隨訪時間18.9 個月。驗證隊列中，男性199例，女性32例；年齡14～74歲，平均(48.3±12.3)歲，隨訪0.1～118.2個月，中位隨訪時間20.4 個月。

1.2.3.2 建模 使用R軟件(版本3.4.3)和軟件包“rpart”進行決策樹分析。參數(shù)設(shè)置：目標變量為肝癌患者預(yù)后，預(yù)測變量為多因素Cox比例風險回歸分析結(jié)果中肝癌預(yù)后的獨立預(yù)測因素，包括腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、血管浸潤、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、Tubulin α-1B、B-raf。通過ROC曲線計算預(yù)測模型的特異度，通過比較不同模型曲線下面積評估模型預(yù)測能力。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后相關(guān)蛋白的確定、表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 從TCGA數(shù)據(jù)庫290個蛋白中篩選出21種與肝癌患者總生存時間相關(guān)的候選蛋白(見圖1A)。利用LASSO邏輯回歸通過降維鑒定出3個預(yù)測標志物：Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf。Kaplan-Meier生存分析顯示，TCGA數(shù)據(jù)庫中這3種蛋白標志物高表達，則肝癌患者預(yù)后差(見圖1B)。通過IHC檢測這3種蛋白在775 例肝癌患者中的表達，結(jié)果顯示Tubulin α-1B 、PAI-1和B-raf 均表達于肝癌細胞的胞質(zhì)中(見圖2A、2D、2G)。相比癌旁肝組織，Tubulin α-1B在肝癌組織中表達上調(diào)，并與肝癌患者生存時間短顯著相關(guān)(見圖2 A～C)，而PAI-1或B-raf的表達在癌旁肝組織和肝癌組織中差異相對較小 (見圖2 D～F和G-I)。在訓練隊列和驗證隊列中，均可觀察到腫瘤分化、血管浸潤和包膜完整與Tubulin α-1B的表達有關(guān)(表1)。而PA1-1和B-raf的表達與臨床病理參數(shù)之間幾乎無相關(guān)性。

圖1 利用TCGA數(shù)據(jù)庫篩選肝癌預(yù)后相關(guān)蛋白

注：A為TCGA RPPA數(shù)據(jù)庫中肝癌預(yù)后相關(guān)蛋白的單因素生存分析；B為TCGA RPPA數(shù)據(jù)庫中3個最重要的肝癌預(yù)后相關(guān)蛋白Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf的Kaplan-Meier生存分析

圖2 相關(guān)蛋白與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性

注：A、D、G為癌旁肝組織、低風險肝癌組和高風險肝癌組中Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf 蛋白表達；B、E、H為 Mann-Whitney檢驗比較癌旁肝組織(N)、肝癌組織(T)以及不同風險組之間Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf 的表達差異；C、F、I為Kaplan-Meier分析775例肝癌患者中Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf 表達與患者總生存時間的相關(guān)性

表1 Tubulin α-1B表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[例(%)]

續(xù)表1

參數(shù)訓練隊列驗證隊列例數(shù)低表達高表達χ2值P值例數(shù)低表達高表達χ2值P值纖維化3.6380.0560.0430.836 陰性9850(51)48(49)4427(61.4)17(38.6) 陽性421259(61.5)162(38.5)184116(63)68(37)腫瘤大小(cm)0.1250.7240.4200.517 <512472(58.1)52(41.9)6744(65.7)23(34.3) ≥5396237(59.8)159(40.2)16299(61.1)63(38.9)腫瘤數(shù)目1.0450.3071.2820.257 單個344199(57.8)145(42.2)14997(65.1)52(34.9) 多發(fā)176110(62.5)66(37.5)8046(57.5)34(42.5)腫瘤分化9.1260.0035.8250.016 高分化4939(79.6)10(20.4)1816(88.9)2(11.1) 中低分化471270(57.3)201(42.7)211127(60.2)84(39.8)TNM分期3.3130.0690.0500.823 I222142(64)80(36)9057(63.3)33(36.7) II～IV298167(56)131(44)13986(61.9)53(38.1)血管浸潤5.1220.0244.8060.028 陰性420260(61.9)160(38.1)188124(66)64(34) 陽性9949(49.5)50(50.5)4019(47.5)21(52.5)包膜3.9750.0466.5580.010 不完整299167(55.9)132(44.1)13374(55.6)59(44.4) 完整220142(64.5)78(35.5)9468(72.3)26(27.7)淋巴轉(zhuǎn)移0.0750.7840.0000.990 陰性485288(59.4)197(40.6)220138(62.7)82(37.3) 陽性3421(61.8)13(38.2)85(62.5)3(37.5)

2.2 Tubulin α-1B 表達與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性 Tubulin α-1B 高表達與肝癌患者OS和DFS短高度相關(guān)(見圖2C)。單變量分析顯示，在訓練和驗證隊列中，腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、包膜完整、血管浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移 和TNM分期，以及Tubulin α-1B 表達是肝癌預(yù)后的預(yù)測因子 。多變量分析表明，在兩個隊列中Tubulinα-1B高表達是肝癌患者預(yù)后差的獨立預(yù)測因素。見表2、3。

表2 在訓練隊列中肝癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

續(xù)表2

變量單因素分析多因素分析HR (95% CI)P 值HR (95% CI)P值DFS 年齡 (<49歲 vs ≥49歲)0.790(0.619～1.006)0.056 性別 (女性 vs 男性)0.898(0.599～1.347)0.603 HBV (陽性 vs 陰性)1.203(0.874～1.656)0.257 腫瘤大小 (<5 cm vs ≥5 cm)1.147(0.869～1.514)0.333 腫瘤數(shù)目 (單個vs 多個)1.072(0.822～1.399)0.606 包膜 (不完整 vs 完整)0.945(0.740～1.206)0.648 肝纖維化 (陽性 vs 陰性)0.865(0.639～1.169)0.345 甲胎蛋白 (<20 ng/mL vs ≥20 ng/mL)1.391(1.021～1.895)0.0361.296(0.938～1.791)0.116 血管浸潤 (陽性 vs 陰性)1.585(1.157～2.169)0.0041.437(1.029～2.007)0.034 分化程度(高分化 vs 低中分化)1.211(0.813～1.806)0.347 TNM (I vs II-IV)1.137(0.890～1.453)0.304 淋巴轉(zhuǎn)移 (陽性 vs 陰性)0.803(0.439～1.471)0.478 PAI-1 (低表達vs 高表達)0.982(0.757～1.273)0.889 Tubulin α-1B (低表達vs 高表達)1.394(1.078～1.802)0.0111.323(1.019～1.716)0.035 B-raf (低表達vs 高表達)1.030(0.784～1.354)0.832

表3 驗證隊列中肝癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

2.3 決策樹模型驗證結(jié)果 依據(jù)肝癌患者存活少于或多于19 個月(肝癌患者的中位生存時間)分為預(yù)后不良組或預(yù)后良好組，將其設(shè)為決策樹目標變量。將多變量分析結(jié)果中的獨立預(yù)測因素納入決策樹分析，將其設(shè)為決策樹預(yù)測變量。在構(gòu)建的決策樹模型(見圖3A)中，初始分叉節(jié)點為TNM分期，Tubulinα -1B 蛋白IHC得分為 4(得分≤4為低表達組，得分>4為高表達組)、腫瘤大小和血管浸潤為決策樹的分叉節(jié)點。由此，決策樹模型分為低風險組(組1a和組1b)、中風險組(組2a和組2b)以及高風險組(組3a和組3b)。預(yù)后好的低風險組具有以下特征之一：①TNM分期I期且Tubulin α-1B 低表達；②TNM分期I期、Tubulin α-1B 高表達且腫瘤大小< 5 cm。中風險組具有以下特性之一：①TNM分期I期、Tubulin α-1B 高表達且腫瘤大小≥5 厘米；②TNM分期II-IV期、Tubulin α-1B 低表達且無血管浸潤。預(yù)后差的高風險組具有以下特征之一：①TNM分期II-IV期且Tubulin α-1B 高表達；②TNM分期II-IV期、Tubulin α-1B低表達且存在血管浸潤。同時，在231例肝癌患者中驗證了構(gòu)建的決策樹模型(見圖3A)。在訓練隊列中，決策樹模型預(yù)測預(yù)后的auROC為0.728(95%CI：0.684～0.772)。Cox模型有類似的準確度，auROC為0.742(95%CI：0.699～0.785，P=0.329 )。在驗證隊列中，決策樹模型和Cox模型也表現(xiàn)出較好的預(yù)測準確性，auROC分別為0. 741(95%CI：0.675～0.806)和0.737(95%CI：0.672～0.802，P=0.456)。決策樹模型、Cox模型及納入CART分析中的臨床病理特征預(yù)測肝癌患者預(yù)后的能力差異如圖3B所示。在訓練和驗證隊列中，決策樹模型評估的風險等級與肝癌患者總生存時間和無病生存時間顯著相關(guān)，表明決策樹模型可預(yù)測肝癌患者預(yù)后風險(見圖3C)。

圖3 決策樹預(yù)后模型和驗證結(jié)果

注：A表示在訓練隊列(n=544)和驗證隊列(n=231)中使用決策樹模型區(qū)分肝癌不同風險組。決策樹的節(jié)點包括TNM分期(根節(jié)點)、Tubulin α-1B 、腫瘤大小和血管浸潤。組1a和組1b為肝癌低風險組；組2a和組2b為肝癌中風險組；組3a和組3b為肝癌高風險組；B為訓練隊列和驗證隊列中決策樹模型、Cox模型以及每個獨立變量預(yù)測肝癌患者預(yù)后的ROC曲線；C為訓練隊列和驗證隊列中使用決策樹模型對肝癌患者預(yù)后進行生存分析

3 討論

由于肝癌治療手段有限及患者預(yù)后差，臨床醫(yī)生正在考慮開發(fā)簡易實用的預(yù)后模型，用于治療決策和預(yù)后評估。本研究構(gòu)建的肝癌組織蛋白表達與臨床病理數(shù)據(jù)相結(jié)合的綜合預(yù)后模型，可預(yù)測肝癌患者預(yù)后。模型中臨床病理參數(shù)，如TNM分期、腫瘤大小和血管浸潤，代表了腫瘤的總體特征，而與預(yù)后相關(guān)的蛋白Tubulin α-1B的表達則在分子水平反映腫瘤的惡性程度。臨床病理參數(shù)與腫瘤組織IHC評分的組合，不僅可以區(qū)分不同的生存風險組，而且符合分子與細胞生物學機理，更重要是在臨床上簡易可行。決策樹模型中鑒定出TNM分期中被忽視的新的患者亞群，同時也體現(xiàn)出了在判斷腫瘤惡性程度中臨床病理數(shù)據(jù)與腫瘤生物學標記之間的相互作用。

本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫，利用LASSO邏輯回歸，鑒定出3個肝癌預(yù)后標志物：Tubulin α-1B、PAI-1和B-raf。其中PAI-1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制纖維蛋白溶酶原激活劑tPA 和uPA[18]。它可調(diào)節(jié)血管內(nèi)纖維蛋白溶解，調(diào)控細胞侵襲和遷移。PAI-1可促進腫瘤血管生成[19]。催乳素可抑制PAI-1 的抗纖溶活性，從而抑制腫瘤的血管形成[20]。PAI-1抑制劑SK-216 可以抑制血管生成，可用于惡性胸膜間皮瘤的治療[21]。B-raf是Raf絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員之一，是MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的組成成分，可介導細胞增殖與遷移[22]。惡性腫瘤的體細胞突變可激活Raf蛋白亞型[23]。微管蛋白是細胞骨架的主要成分，其主要生物學功能與細胞黏附、運動、DNA復(fù)制和細胞分裂有關(guān)[24]。已發(fā)現(xiàn)幾個微管蛋白家族成員參與腫瘤進展[25]。α-tubulin乙?；纳咴黾恿巳橄侔┑霓D(zhuǎn)移潛力[26]。Tubulin α-1B 在肝癌組織中表達上調(diào)可促進肝癌細胞增殖，且Tubulin α-1B 高表達與肝癌患者總生存時間短以及紫杉醇耐藥相關(guān)[27]。本研究即通過IHC評估肝癌組織中Tubulin α-1B 中的表達，結(jié)合臨床病理資料，構(gòu)建決策樹模型來預(yù)測肝癌患者的預(yù)后。

本研究通過CART方法構(gòu)建決策樹進行多變量分析。CART分析是一種機器學習算法，可以通過使用臨床病理數(shù)據(jù)和生物標志物表達量來預(yù)測患者總生存。決策樹模型與傳統(tǒng)多元回歸方法建模相比具有多項優(yōu)勢。首先，決策樹模型不受缺失數(shù)據(jù)限制，例如臨床數(shù)據(jù)部分缺失或IHC染色失敗。統(tǒng)計結(jié)果適用于所有納入研究的臨床病例。其次，決策樹模型可以明確輸入變量之間的復(fù)雜的交互作用，并提供“if-then”規(guī)則來支持判斷和決策。在本研究中，雖然TNM分期主導了決策樹模型中上級決策規(guī)則，但生物標記物有助于下級決策的制定。第三，相比于從邏輯回歸衍生出的復(fù)雜模型[28]，決策樹模型使用圖形方式顯示決策方式更加容易理解和應(yīng)用。但本研究仍存在不足之處。首先，CART分析具探索性。納入風險因素的重要性可能被高估或出現(xiàn)模型的過擬合。其次，由于本研究是回顧性的，可能會產(chǎn)生一定的數(shù)據(jù)偏差。第三，本組數(shù)據(jù)是單中心的，決策樹模型的構(gòu)建與驗證均在同中心檢測。因此，需要進行更大范圍的多中心前瞻性研究，以改善和進一步驗證決策樹模型。

綜上所述，利用肝癌患者的臨床病理信息和預(yù)后相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)，采用決策樹方法構(gòu)建肝癌的預(yù)后模型，可用于肝癌患者危險分層和預(yù)后評估。