張麗，宋馨宇,4，陳磊，張衛(wèi)文,4

·綜 述·

光合微生物混菌體系的應(yīng)用和研究進(jìn)展

張麗1,2,3，宋馨宇1,2,3,4，陳磊1,2,3，張衛(wèi)文1,2,3,4

1 天津大學(xué) 化工學(xué)院合成微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072 2 教育部合成生物學(xué)前沿研究中心，天津 300072 3 教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072 4 天津大學(xué) 生物安全戰(zhàn)略研究中心，天津 300072

光合微生物與其他異養(yǎng)微生物混菌共培養(yǎng)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，該體系彌補(bǔ)了光合微生物純培養(yǎng)時(shí)易染菌、不穩(wěn)定等缺陷，在污水處理、土壤改善、生物降解有害物質(zhì)、生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。文中通過(guò)系統(tǒng)總結(jié)天然和人工光合微生物混菌體系的研究進(jìn)展，探究人工構(gòu)建的光驅(qū)動(dòng)混菌體系的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用前景，為進(jìn)一步利用合成生物學(xué)等前沿技術(shù)理性改造基于光合微生物的混菌培養(yǎng)系統(tǒng)提供科學(xué)依據(jù)。

光合微生物，混菌體系，環(huán)境工程，細(xì)胞工廠，相互作用

光合微生物是一類能夠利用太陽(yáng)能和二氧化碳作為唯一能源和碳源，進(jìn)行自養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的生物。光合微生物與其他異養(yǎng)菌形成的混菌體系在自然界中普遍存在，例如人們熟悉的地衣，即為這一類體系的典型代表。在地衣中，光合微生物利用太陽(yáng)光進(jìn)行光合作用合成有機(jī)物，為真菌生長(zhǎng)繁殖提供所需的碳源，而真菌能向光合微生物提供生長(zhǎng)因子和運(yùn)輸無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)還能對(duì)光合微生物起到保護(hù)作用[1]。

光合微生物與異養(yǎng)菌之間相互關(guān)系的存在可增強(qiáng)混菌體系成員響應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境的能力，從而更好地在自然界中生存下去[2-4]。仍舊以地衣為例，這種常見(jiàn)的自然混菌體系有著極強(qiáng)的適應(yīng)能力與抗逆性，能夠作為先鋒生物在高山帶、凍土帶和南北極地區(qū)等極端條件下生存，且共存時(shí)間很長(zhǎng)，有的壽命甚至可達(dá)千年[5-6]。除此之外，還有像缺乏維生素B12相關(guān)代謝途徑的萊茵衣藻與可產(chǎn)維生素B12相關(guān)的異養(yǎng)菌共存、慢生根瘤菌與固氮螺菌的共存等[7-8]。更值得關(guān)注的是，光合微生物混菌體系還有改善生態(tài)環(huán)境的功能，比如污水的凈化、水體污染物的降解以及促進(jìn)農(nóng)藥降解等諸多生態(tài)學(xué)意義[9-11]。自然環(huán)境的污水中存在大量的異養(yǎng)微生物群落，藻類的光合作用和異養(yǎng)菌的代謝及呼吸作用能協(xié)同降解污水中的有機(jī)物，并能實(shí)現(xiàn)同步脫氮除磷及抗生素、重金屬的去除。Loutseti等[12]利用菌藻混菌系統(tǒng)處理銅、鈣污水，離子去除效率分別達(dá)到80%和100%；隨后，Bai 和Achary[13]采用菌藻混菌系統(tǒng)處理磺胺甲惡唑、三氯生污水，處理效率分別達(dá)到32%和74%。很多研究還證實(shí)，光合微生物和土壤中的異養(yǎng)細(xì)菌通過(guò)建立相互作用，能夠顯著增加農(nóng)作物的微量元素與蛋白質(zhì)的含量，這對(duì)植物的生長(zhǎng)有著非常重要的作用[14-17]。Naind等[18]將變形桿菌中的普羅威登斯菌sp.與3種藍(lán)細(xì)菌構(gòu)建混菌體系混合添加到土壤中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的小麥與普通條件下相比在種質(zhì)上有明顯的改善。這些研究證明光合微生物混菌體系在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中有著重要的價(jià)值。因此，對(duì)天然存在光合微生物混菌體系的相關(guān)理論與應(yīng)用的研究就顯得尤為重要。

由于經(jīng)過(guò)數(shù)億年的進(jìn)化已經(jīng)適應(yīng)了特定的生活環(huán)境，天然光合微生物混菌體系在穩(wěn)定性上有一些優(yōu)勢(shì)，但是同時(shí)也使得其應(yīng)用的靈活性與廣泛性受到限制。近年來(lái)，合成生物學(xué)的發(fā)展給混菌系統(tǒng)的應(yīng)用開(kāi)辟了新的方向。合成生物學(xué)旨在以工程學(xué)思想作為指導(dǎo)，通過(guò)從頭設(shè)計(jì)和構(gòu)建，能夠?qū)ΜF(xiàn)有的和天然的生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造[19]。美國(guó)科學(xué)家Ducat等[20]通過(guò)向聚球藻PCC 7942中引入蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因B并結(jié)合系統(tǒng)改造，獲得蔗糖產(chǎn)率高達(dá)28 mg/(L·h) 的藍(lán)細(xì)菌菌株。這個(gè)產(chǎn)率足以支持一定的異養(yǎng)菌的生長(zhǎng)，因此Ducat等嘗試?yán)酶弋a(chǎn)蔗糖的. PCC 7942菌株與玻利維亞鹽單胞菌[21]、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等[22]構(gòu)建人工混菌系統(tǒng)，最終實(shí)現(xiàn)了聚羥基丁酸脂 (Polyhydroxybutyrate，PHB)、淀粉酶等多種高附加值物質(zhì)的生產(chǎn)，這一工作也證明了合成生物學(xué)技術(shù)和策略在混菌系統(tǒng)應(yīng)用中的價(jià)值。

文中將對(duì)光合微生物混菌體系的優(yōu)勢(shì)、光合微生物混菌體系的應(yīng)用以及對(duì)光合微生物混菌體系機(jī)理的解析等方面進(jìn)行系統(tǒng)的概述，同時(shí)還對(duì)現(xiàn)階段光合微生物混菌體系存有的問(wèn)題進(jìn)行分析與總結(jié)，并對(duì)光合微生物混菌體系的應(yīng)用前景作出展望。

1 光合微生物混菌體系的優(yōu)勢(shì)

光合微生物混菌體系中不同菌株之間存在相互作用，這是與純培養(yǎng)最本質(zhì)的差別，這種關(guān)系的存在使得混菌體系表現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢(shì)，以下將逐一介紹。

1.1 增加體系的穩(wěn)定性與魯棒性

研究表明，過(guò)于劇烈的光波動(dòng)會(huì)對(duì)光系統(tǒng)Ⅰ (PSⅠ) 造成損傷[23]，同時(shí)，由于不同的光強(qiáng)的變化使得光合微生物本身需要通過(guò)一系列的生理調(diào)整來(lái)適應(yīng)生存環(huán)境，其中為了還原由光反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)多氧氣 (O2)，在化學(xué)還原O2的同時(shí)會(huì)生成過(guò)氧化氫 (H2O2)，這種活性氧物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重抑制光合微生物自身的生長(zhǎng)[24-25]。Ducat等[22]通過(guò)將高產(chǎn)糖PCC 7942與W303可利用蔗糖的突變株進(jìn)行混合培養(yǎng)，該混菌體系在光-暗交替 (16 h光照/8 h黑暗)條件下，雙菌在數(shù)月內(nèi)都可維持生物量的穩(wěn)定。由于酵母的存在可以很好地清除培養(yǎng)基中的活性氧物質(zhì)，因此這種培養(yǎng)模式與其各自菌株的純培養(yǎng)相比，體系的穩(wěn)定性大幅度提高。

1.2 提高生產(chǎn)過(guò)程中底物的利用效率

含有淀粉和纖維素的廢棄生物質(zhì)如秸稈等，可用作生物氫 (H2) 生產(chǎn)的廉價(jià)原料[26]。通常，傳統(tǒng)的生物氫生產(chǎn)是以含有淀粉的生物質(zhì)作為基底，并利用經(jīng)過(guò)熱處理的活性厭氧污泥和梭菌屬和腸桿菌屬的純培養(yǎng)物通過(guò)黑暗發(fā)酵進(jìn)行[27]，由于活性污泥和異養(yǎng)菌在發(fā)酵的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸 (VFA) 與二氧化碳 (CO2)，仍舊造成了部分碳源的損失。鑒于此，Kargi等將經(jīng)過(guò)熱處理的活性污泥 (Anaerobic sludge，AS) 與光合微生物紅細(xì)菌NRRL-B 1727進(jìn)行混合培養(yǎng)[28-30]。通過(guò)在黑暗條件下活性污泥水解生物質(zhì)中的淀粉生成葡萄糖供給污泥中的異養(yǎng)菌和NRRL-B 1727生成VFA，隨后，在光照條件下NRRL-B 1727可利用的VFA進(jìn)行H2的再生產(chǎn)。該混菌體系在96 h內(nèi)可將底物中的淀粉完全分解成H2與VFA，H2轉(zhuǎn)化效率為201 mL/g淀粉，最高產(chǎn)率達(dá)377 μmol/h，與純異養(yǎng)菌發(fā)酵相比提高了12.9%[31]。

1.3 提升高附加值物質(zhì)的生產(chǎn)能力

萊茵衣藻是一種重要的模式藻類物種，它具有很高的氫化酶活性，加之易于遺傳操作和易培養(yǎng)，已廣泛用于光解介導(dǎo)的H2產(chǎn)生的研究[32-33]。但是氫化酶對(duì)氧氣 (O2)非常敏感，在高O2濃度下極易失活。Luo等[34]一項(xiàng)研究中證實(shí)，假單胞菌sp.BS4可促進(jìn)在光介導(dǎo)的條件下生產(chǎn)H2，在BS4-共培養(yǎng)的過(guò)程中，體系內(nèi)的O2被異養(yǎng)菌迅速消耗，從而形成一個(gè)厭氧環(huán)境，這種環(huán)境被證明非常適合于藻類氫化酶的活化，使之發(fā)揮更好的作用。此外，該研究還證實(shí)，BS4的存在能夠減緩微藻葉綠素的消耗，增強(qiáng)微藻的淀粉積累和維持蛋白質(zhì)含量，使得微藻得到更好的生長(zhǎng)與H2生產(chǎn)能力。

2 光合微生物混菌體系的應(yīng)用

由于光合微生物混菌體系具有諸多優(yōu)勢(shì)，已在環(huán)境工程、微生物細(xì)胞工廠等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用 (表1)。

2.1 環(huán)境工程應(yīng)用

2.1.1 地表污水處理

大量的工業(yè)生產(chǎn)及人類活動(dòng)使得地表水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累過(guò)剩，從而引起嚴(yán)重的地表水污染[35]。為避免自然水體的富營(yíng)養(yǎng)化、保證健康的水生生態(tài)系統(tǒng)，水體中總氮量 (TN) 含量應(yīng)低于0.3 mg/L，總磷量 (TP) 含量應(yīng)低于0.02 mg/L[36-39]。傳統(tǒng)的物理化學(xué)污水處理方式具有高耗能、高成本、污染物處理不徹底、易形成二次污染等缺陷，生物法處理廢水是近幾年來(lái)興起的一種高效清潔的方式，主要利用光合微生物的混菌體系進(jìn)行 (圖1A–B)。光合微生物可以有效地利用廢水中的氮、磷進(jìn)行生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生異養(yǎng)菌所必需的氧氣，體系中的異養(yǎng)菌由此去分解廢水中的有機(jī)污染物。根據(jù)此特點(diǎn)，許多微藻和異養(yǎng)菌根據(jù)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與分解能力在自然界中被分離出來(lái)[34,37]。例如，Vyverman等[39]報(bào)道了絲狀微囊藻中的剛毛藻、克里藻以及魚(yú)腥藻等對(duì)氮、磷物質(zhì)具有很高的吸收能力。這些藻類在實(shí)驗(yàn)室條件下 (23 ℃)，氮物質(zhì)的吸收率分別為55.9–70.6 mg NO3–-N/(g DW·d)；磷物質(zhì)的吸收率分別為12.7–27.5 mg PO43–-P/(g DW·d)。除此之外，這些藻類對(duì)環(huán)境還有著良好的適應(yīng)性，在15 ℃至超過(guò)35 ℃的溫度下和pH 3–9范圍內(nèi)都可以很好地生長(zhǎng)，這極大增加了處理污水的適用性范圍[40-41]，在養(yǎng)殖廢水、河湖水、城市廢水等的凈化中都有很好的應(yīng)用[42]。

表1 光合微生物混菌體系的應(yīng)用

2.1.2 土壤修復(fù)

自然和人類活動(dòng)都有可能導(dǎo)致土壤肥力退化和鹽漬化。目前，世界各地約有10億hm2的鹽漬化土地，若將這些鹽堿化土地修復(fù)，將會(huì)得到極大的土壤資源[43]。傳統(tǒng)的土壤脫鹽方式主要有浸出、去除表面鹽堿層、電場(chǎng)以及其他物理方法等[44]。一般來(lái)說(shuō)，物理方法通常只作用于上層土壤，且在脫鹽的過(guò)程中容易導(dǎo)致土壤肥力的降低[45]。一些光合微生物如念珠藻、魚(yú)腥藻等在固氮、產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和相容溶質(zhì) (通常為胞外多糖物質(zhì)) 上有著突出的能力，這種能力對(duì)土壤肥力恢復(fù)以及脫鹽漬化有著極其重要的作用[43]。在脫鹽的過(guò)程中，光合微生物通常與其他異養(yǎng)微生物共同作用以改善土壤鹽度，這種過(guò)程是單一物種所無(wú)法完成的，圖1C展示了混菌體系作用于土壤修復(fù)的過(guò)程。混菌體系工作能力通常由生物量的生長(zhǎng)與胞外多糖物質(zhì)的生產(chǎn)能力來(lái)表征[43]。高鹽度[46]、高藍(lán)光[47]、氮饑餓[48]等條件有利于藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)胞外多糖物質(zhì)，而異養(yǎng)菌的存在還可以調(diào)節(jié)胞外多糖的分子量、支化度、取代基數(shù)以及超微分子結(jié)構(gòu)等[10]，進(jìn)而影響胞外多糖的性質(zhì)，使之適用于不同的鹽漬土壤類型。此外，藍(lán)細(xì)菌還可以與土壤中的細(xì)菌、真菌進(jìn)行復(fù)雜的相互作用以此共同改善土壤環(huán)境，提高土壤肥力。Prasanna等[49]首次闡明了細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌菌株之間的積極和動(dòng)態(tài)相互作用及其在提升小麥等農(nóng)作物產(chǎn)量上的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)在額外添加了一種藍(lán)藻和兩種異養(yǎng)菌的土壤中所長(zhǎng)出的小麥與接種在施加全劑量磷鉀肥料的相比，麥穗重量增加了2倍。此外，土壤微生物學(xué)測(cè)定中還發(fā)現(xiàn)接種了混菌體系的土壤中脫氫酶、FDA水解酶、堿性磷酸酶的活性以及微生物生物量都有顯著提高。在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，混菌體系應(yīng)用在土壤中還可以降低40–80 kg N/hm2的氮源成本。Naind等[18]將變形桿菌中的普羅威登斯菌sp.與兩種魚(yú)腥藻sp.與眉藻sp.混合添加到土壤，與普通肥料 (N60P60K60) 相比，接種了藍(lán)細(xì)菌的混菌土壤中長(zhǎng)出的小麥麥粒的蛋白質(zhì)含量增加18.6%，F(xiàn)e、Mn和Cu三種微量元素分別增加105.3%、36.7%和150.0%。

圖1 光合微生物混菌體系示意圖

2.1.3 生物降解

金屬離子也會(huì)對(duì)藻類生物產(chǎn)生毒性，當(dāng)在其生存環(huán)境中金屬離子較高時(shí)，藻類會(huì)表現(xiàn)出系統(tǒng)的、特異性的應(yīng)激反應(yīng)[50-52]。實(shí)驗(yàn)證明，金屬離子可以被主動(dòng)攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行代謝淬滅，或作為避免細(xì)胞中毒的防御工具，微藻在生長(zhǎng)的過(guò)程中也會(huì)釋放一些金屬螯合劑，此外藻類生存環(huán)境的pH值普遍偏高，這也會(huì)導(dǎo)致相關(guān)重金屬離子的沉淀[53-54]。但通常情況下，單一的光合微生物對(duì)金屬離子的耐受性較差，在應(yīng)用之前需要進(jìn)行長(zhǎng)期的馴化過(guò)程，且處理的金屬種類較為單一[55]。有研究證實(shí)，許多光合微生物混菌體系可以絡(luò)合重金屬離子以及對(duì)有機(jī)污染物進(jìn)行降 解[56-57]。因此“藻類-細(xì)菌”混菌體系會(huì)在金屬離子豐富的環(huán)境中相互排毒和同化金屬，這種機(jī)制使得混菌體系在相同條件下可以比單培養(yǎng)體系處理更多種類的金屬離子。此外，Subashchandrabose等報(bào)道了混菌體系可以有效降解久效磷、喹硫磷和甲基對(duì)硫磷等有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑[58]，還發(fā)現(xiàn)混菌體系具有降解多種農(nóng)藥包括DDT、阿特拉津、α-硫丹的功能[54]。Mahdavi與Mu?oz等[53-54,59]發(fā)現(xiàn)光合微生物對(duì)有包括黑油、乙腈、苯酚、萘、苯并芘、二苯并呋喃、偶氮化合物等在內(nèi)的有機(jī)污染物的處理，利用混菌體系降解酚類物質(zhì)的效率可達(dá)100%，然而單獨(dú)使用四尾柵藻的降解率只有27%[60]。Tang等[57]報(bào)道了一項(xiàng)利用斜生柵藻GH2與4種可以降解不同污染物的異養(yǎng)菌組成的人工混菌體系進(jìn)行原油降解的研究，該研究可同時(shí)降解原油中的多種物質(zhì)。利用該混菌體系進(jìn)行原油降解時(shí)，直鏈烷烴幾乎完全被降解。Ryu等[9]研究中還發(fā)現(xiàn)了光合微生物混菌體能夠降解廢水中的有毒物質(zhì)硫氰酸鹽。

2.2 微生物細(xì)胞工廠

2.2.1 脂質(zhì)生產(chǎn)

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoate，PHA)是目前發(fā)現(xiàn)的在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)作為碳和能量?jī)?chǔ)存化合物最豐富的中性脂質(zhì)[61]。用混菌培養(yǎng)方式生產(chǎn)PHA的研究已經(jīng)非常成熟，但研究最多仍為異養(yǎng)菌混菌體系[62-65]。菌藻共混合培養(yǎng)生產(chǎn)PHA由Fradinho等[66]首次提出，該體系對(duì)PHA進(jìn)行生產(chǎn)主要由“富集PHA合成菌株”與“PHA批量合成”兩個(gè)階段組成[66]。第一階段使用“飽足-饑餓”模式 (Feast and famine regime)。PHA的積累需要以乙酸作為底物，因此首先使活性污泥中的異養(yǎng)菌在底物乙酸充足的階段積累PHA，底物消耗殆盡之后部分異養(yǎng)菌會(huì)為了維持生存開(kāi)始利用藻類產(chǎn)生的氧氣消耗自身合成的PHA。通過(guò)上述模式的往復(fù)循環(huán)，能在藻類存在條件下生產(chǎn) PHA的異養(yǎng)菌菌株存活下來(lái)，從而達(dá)到富集PHA生產(chǎn)菌株的目的。第二階段通過(guò)連續(xù)添加底物乙酸來(lái)使菌群連續(xù)不斷地產(chǎn)生PHA而不被消耗，達(dá)到生產(chǎn)PHA的目的。研究中菌體最高PHA含量為20%，經(jīng)過(guò)篩選后的體系，菌藻混菌體系與純異養(yǎng)體系相比具有更高的PHA產(chǎn)量，并且利用菌藻間的相互關(guān)系使得體系在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可以穩(wěn)定存在，實(shí)現(xiàn)PHA的連續(xù)化生產(chǎn)。

2.2.2 多糖生產(chǎn)

微生物的胞外多糖是一種具有廣泛用途的高聚物，例如，β-D-葡聚糖具有免疫調(diào)節(jié)和腫瘤抑制的功能，細(xì)菌纖維素可以應(yīng)用于聲卡膜的制造以及透明質(zhì)酸可以應(yīng)用于化妝品中等[67]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生胞外多糖的微生物約有 49屬76種[68]。Angelis等[10]報(bào)道了一種將微藻、藍(lán)細(xì)菌和大型真菌共培養(yǎng)的混菌體系用于胞外多糖的生產(chǎn)。該項(xiàng)研究首先基于單一培養(yǎng)體系的生物量和胞外多糖的生產(chǎn)力，篩選出螺旋藻和小球藻兩種光合微生物，以及靈芝、香菇、栓菌、側(cè)耳、落葉松蕈5種真菌，并在不同的共培養(yǎng)物中培養(yǎng)。通過(guò)13C NMR光譜和氣質(zhì)聯(lián)用對(duì)來(lái)自單一和混菌體系的水溶性胞外多糖分進(jìn)行表征與比較，發(fā)現(xiàn)混菌體系生產(chǎn)的胞外多糖的種類與純培養(yǎng)相比有著很大的差別，從分子結(jié)構(gòu)上鑒定出了很多新型多糖。在此基礎(chǔ)上，為了實(shí)現(xiàn)多糖的最大生產(chǎn)，Angelis等[10]還對(duì)共培養(yǎng)條件，如溫度、攪拌速度、真菌和微藻接種率、初始pH、光照強(qiáng)度和葡萄糖濃度等進(jìn)行摸索，最終使多糖和生物質(zhì)產(chǎn)量與單培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌相比分別增加33%和61%。

2.2.3 生物產(chǎn)氫

將混菌體系用于生物產(chǎn)氫已經(jīng)有很多報(bào)道。例如，Miura等[69]將萊茵衣藻MGA 161與海洋光合細(xì)菌菌株W-1S共培養(yǎng)進(jìn)行氫氣生產(chǎn)。在此過(guò)程中，MGA 161可作為氫光解的電子供體，經(jīng)優(yōu)化后的該體系的氫氣產(chǎn)量可達(dá)0.083 μmol/h。Kawaguchi等[70]通過(guò)將海紅菌A-501的培養(yǎng)物與淀粉乳桿菌和藻類生物質(zhì)混合將藻類淀粉代謝為乳酸鹽作為電子供體，改善了混菌體系使之更有利于產(chǎn)氫。在混合培養(yǎng)條件下，氫氣的產(chǎn)率較單培養(yǎng)提高1.5倍，產(chǎn)量提高1.4倍，最高產(chǎn)率可達(dá)100.75 μmol/h。近年來(lái)，Wu等[71-72]將萊茵衣藻與慢生型大豆根瘤菌或圓褐固氮菌進(jìn)行混合培養(yǎng)生產(chǎn)氫氣，氫氣產(chǎn)率分別達(dá)到0.42 μmol/h和0.36 μmol/h，最高已達(dá)到萊茵衣藻產(chǎn)氫速率的17倍。同時(shí)期，Luo等[33]發(fā)現(xiàn)受污染的菌液中有較高的氫氣積累，并通過(guò)一系列的研究證實(shí)了受污染菌液中含有的假單胞菌sp. BS4可以促進(jìn)氫氣的生產(chǎn)，經(jīng)優(yōu)化后的混菌體系氫氣產(chǎn)率可達(dá)811 μmol/h。該異養(yǎng)菌除了可協(xié)助萊茵衣藻產(chǎn)氫之外，對(duì)小球藻屬、柵藻屬等光合微生物的產(chǎn)氫也有良好的促進(jìn)作用。

3 光合微生物混菌系統(tǒng)的解析

混菌體系成員之間存在某種相互關(guān)系，這種相互關(guān)系的存在是與純培養(yǎng)最本質(zhì)的差別，因此對(duì)混菌成員之間相互關(guān)系的解析也有助于我們進(jìn)一步理解與應(yīng)用混菌體系 (表2)。

3.1 代謝缺陷彌補(bǔ)

Li等[73]通過(guò)宏基因組分析探究了聚球藻PCC 7002與其他兩種淡水異養(yǎng)微生物——假單胞菌TAIHU和根瘤菌sp. TAIHU在高鹽度條件下所形成的穩(wěn)定混菌體系間的相互關(guān)系。該研究發(fā)現(xiàn)，為了應(yīng)對(duì)共培養(yǎng)中的高鹽環(huán)境，PCC 7002會(huì)合成并分泌包括蔗糖和甘油葡萄糖在內(nèi)的一些滲透相容性物質(zhì)，這些物質(zhì)除了為體系提供對(duì)抗?jié)B透壓、減輕細(xì)胞損傷的作用之外，也被認(rèn)為作為異養(yǎng)細(xì)菌可利用的潛在碳源或氮源。而異養(yǎng)菌sp. TAIHU攜帶支持PCC 7002正常生長(zhǎng)所需的所有涉及維生素B12的從頭生物合成的基因，以合成維生素B12供藍(lán)藻生長(zhǎng)使用。同時(shí)，兩種異養(yǎng)菌有著強(qiáng)大的脂肪分解能力可為藍(lán)藻提供更多的可利用碳源與能量。

除此之外，TAIHU在高鹽度條件下也會(huì)分泌一種常見(jiàn)的滲透相容性物質(zhì)——四氫嘧啶，而負(fù)責(zé)四氫嘧啶及其衍生物的分解代謝的基因僅存在于sp. TAIHU中，這在高鹽度條件消失時(shí)去除水體多余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非常重要。同時(shí)期，Nelson等[74]也對(duì)一些聚生體中存在的無(wú)法從頭合成必需的B族維生素相關(guān)酶輔助因子微生物的存活機(jī)制進(jìn)行了解析，并發(fā)現(xiàn)混菌體系依賴輔助因子的同種異體代謝作為優(yōu)化的生存策略。這種生存策略可以更好地發(fā)揮各個(gè)菌種的優(yōu)勢(shì)，使得混菌體系更加穩(wěn)定。

Christie-Oleza等[75]使用天然存在于海洋中的“”相互作用作為光合自養(yǎng)-異養(yǎng)生物模型的研究。研究發(fā)現(xiàn)，雖然在體系中充分發(fā)揮著生產(chǎn)者的作用為異養(yǎng)生物提供賴以生存的有機(jī)碳源。但除了陽(yáng)光和CO2，的生存同樣也依賴異養(yǎng)生物對(duì)海洋中一些有機(jī)物分解與礦化所產(chǎn)生的含氮、磷等物質(zhì)。這種代謝彌補(bǔ)的生存方式使得更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在混菌系統(tǒng)乃至海洋生物圈中循環(huán)，該研究顛覆了海洋光自養(yǎng)生物和異養(yǎng)生物競(jìng)爭(zhēng)相同的稀缺營(yíng)養(yǎng)物和生態(tài)位空間的普遍看法。與此相反，由于它們?cè)陂L(zhǎng)期穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中的互補(bǔ)性，它們更可能相互受益。

表2 混菌系統(tǒng)機(jī)理解析

3.2 營(yíng)養(yǎng)限制解除

在碳源匱乏的生存條件下，一些光合微生物混菌體仍可生存。Beliaev等[76]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析解釋了PCC 7002與腐敗極毛桿菌W3-18-1之間的相互關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，除了通過(guò)乳酸氧化或光合固定碳來(lái)解除部分碳限制從而發(fā)生生長(zhǎng)偶聯(lián)之外，W3-18-1中一些相應(yīng)的生物物質(zhì)合成的基因，如丙氨酸、甲硫氨酸合成基因的下調(diào)，這表明PCC 7002可為生存環(huán)境提供特定的氨基酸。研究還發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)期間，PCC 7002中與Fe調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的mRNA水平廣泛降低，表明PCC 7002在共培養(yǎng)期間更容易獲取鐵元素。此外，Bernstein等[77]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析解析了嗜熱聚球藻BP-1與紅色亞棲桿菌A之間的相互作用關(guān)系。BP-1可以為A提供有機(jī)碳、氧氣和還原氮，并且由于異養(yǎng)菌的存在，藍(lán)細(xì)菌生物量的積累和由高濃度溶解的氧氣誘導(dǎo)的抗應(yīng)激性均增加。該研究闡明了初級(jí)生產(chǎn)者藍(lán)細(xì)菌通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝基因的表達(dá)水平，如光合作用、碳吸收/固定、維生素合成和活性氧物質(zhì) (Reactive oxygen species，ROS) 清除的核心基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)異養(yǎng)菌的存在。該研究指出，異養(yǎng)細(xì)菌可以間接調(diào)節(jié)光合自養(yǎng)初級(jí)生產(chǎn)者的基因表達(dá)，導(dǎo)致其一系列的生理變化。

4 合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建人工合成混菌體系

4.1 適應(yīng)混菌體系構(gòu)建的光合微生物改造

自然界中由于長(zhǎng)期進(jìn)化而形成的光合微生物混菌體系不勝枚舉，但在應(yīng)用的過(guò)程中缺少靈活性與普適性。如前所述，蔗糖作為一種常見(jiàn)的碳源，其被證實(shí)是光合微生物尤其是淡水藍(lán)細(xì)菌內(nèi)最具代表性的碳水化合物代謝物。大多數(shù)淡水藍(lán)藻菌株在遭遇鹽脅迫的環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)會(huì)合成并積累蔗糖作為相容性溶質(zhì)，以抵抗鹽脅迫并維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡，從而保持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[78]。對(duì)于天然藍(lán)藻細(xì)胞，當(dāng)胞內(nèi)積累的蔗糖濃度足以抵抗外界的滲透壓時(shí)，蔗糖的合成和降解就處于一種平衡狀態(tài)，這種天然的蔗糖代謝調(diào)控模式從根本上限制了藍(lán)細(xì)菌蔗糖產(chǎn)量的提升。為了突破這種限制，Ducat等[20]將來(lái)自W (一種可天然利用蔗糖的大腸桿菌)的B基因?qū)隤CC 7942，首次實(shí)現(xiàn)了藍(lán)細(xì)菌胞內(nèi)蔗糖的胞外分泌。該方式有效突破了藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成能力的瓶頸，為后續(xù)的人工構(gòu)建光合微生物混菌體系奠定了基礎(chǔ)。

4.2 人工光合微生物混菌培養(yǎng)體系的建立與應(yīng)用

利用藍(lán)細(xì)菌合成有機(jī)碳源供給異養(yǎng)菌的生長(zhǎng)，是目前構(gòu)建人工光合微生物混菌培養(yǎng)體系的主流方向。Ducat等[20]通過(guò)直接向產(chǎn)糖PCC 7942體系中接種，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞在此體系中可以很好地維持生存，初步證實(shí)了人工構(gòu)建光合微生物混菌體系的可行性。以此為基礎(chǔ)，Ducat等[22]繼續(xù)探索了3種經(jīng)典的工程菌 (大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌)與產(chǎn)糖PCC 7942的共培養(yǎng)狀況。該研究顯示，大腸桿菌和酵母菌與藍(lán)細(xì)菌的混菌體系能夠較為穩(wěn)定地維持?jǐn)?shù)周到數(shù)月的時(shí)間，而且在面對(duì)環(huán)境波動(dòng) (主要為光照的節(jié)律性變化)時(shí)，該體系展現(xiàn)了很強(qiáng)的魯棒性并能夠?qū)崿F(xiàn)一定的高附加值產(chǎn)品的合成，如聚羥基丁酸酯PHB和淀粉酶。隨后，Ducat等[21]利用固定化策略對(duì)人工合成混菌體系進(jìn)行了優(yōu)化，使用海藻酸鈉對(duì)產(chǎn)糖PCC 7942進(jìn)行包埋固定化。這種固定化處理方式已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞的生存與產(chǎn)糖影響較小，且可以有效地限制細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)，使得通過(guò)生長(zhǎng)消耗的碳源可以更加有效地轉(zhuǎn)移到蔗糖生產(chǎn)方面。與非固定化狀態(tài)相比進(jìn)行了包埋固定化的產(chǎn)糖PCC 7942產(chǎn)糖效率提高了3倍左右。將其與玻利維亞鹽單胞菌(天然的PHB生產(chǎn)者)進(jìn)行共培養(yǎng)，該人工合成的混菌體系可維持長(zhǎng)達(dá) 5個(gè)月的培養(yǎng)時(shí)間，并且在培養(yǎng)過(guò)程中始終維持著生物量穩(wěn)定與PHB產(chǎn)量的持續(xù)增長(zhǎng)。同樣的，該體系也對(duì)環(huán)境波動(dòng)與外來(lái)微生物污染表現(xiàn)出極強(qiáng)的魯棒性與抵抗能力，不需要額外添加抗生素等策略用以維持體系穩(wěn)定。此外，Ducat等還證實(shí)，除之外，還可將共培養(yǎng)菌株替換成可用于PHB生產(chǎn)的大腸桿菌，這充分表明了人工合成混菌體系靈活性與普適性。但就現(xiàn)有研究來(lái)看，構(gòu)建人工混菌體系時(shí)所用到的異養(yǎng)菌必須具備蔗糖的利用能力，而許多異養(yǎng)菌無(wú)法天然利用蔗糖作為碳源。因此需要對(duì)異養(yǎng)微生物進(jìn)行可蔗糖利用化的改造。鑒于此，Lowe等[79]將來(lái)自天然可利用蔗糖的W中的AB系統(tǒng)導(dǎo)入惡臭假單胞菌，其中A是蔗糖水解酶，可將蔗糖水解成葡萄糖與果糖，B則可促進(jìn)蔗糖由胞外轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)，這樣就擁有了蔗糖利用能力，并由此構(gòu)建了可以進(jìn)行PHA合成的光驅(qū)動(dòng)混菌系統(tǒng)。

4.3 人工光合微生物混菌體系的拓展與機(jī)理研究

為了更好地了解并利用人工合成混菌系統(tǒng)進(jìn)行研究，Smith等[80]利用棕色固氮菌與產(chǎn)糖PCC 7942構(gòu)建混菌體系，設(shè)計(jì)了一種雙向互通式共生系統(tǒng)。該系統(tǒng)里，藍(lán)藻為提供蔗糖作為碳源，還可以為藍(lán)藻提供氮源，相較于上述體系有了進(jìn)一步的優(yōu)化，無(wú)需額外添加任何有機(jī)氮源與碳源即可進(jìn)行高附加值產(chǎn)物的合成。在現(xiàn)階段的研究中，混菌體系中的異養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)完全依賴于藍(lán)細(xì)菌所分泌的蔗糖，但有趣的是，異養(yǎng)微生物也同時(shí)促進(jìn)藍(lán)藻的生長(zhǎng)，圖1D為人工合成混菌體系的模式圖。Ducat等[22]的研究已經(jīng)證實(shí)，混菌培養(yǎng)下每毫升菌液藍(lán)藻的細(xì)胞數(shù)是單培養(yǎng)下的2–3倍，但有關(guān)這種促進(jìn)作用的具體機(jī)理仍處于研究階段。藍(lán)藻進(jìn)行光合作用容易產(chǎn)生活性氧，其在培養(yǎng)基中大量積累會(huì)抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)，Li等[81]在研究產(chǎn)糖PCC 7942和黏紅酵母組成的人工混菌體系時(shí)發(fā)現(xiàn)的存在可有效清除體系內(nèi)的活性氧物質(zhì)從而解除藍(lán)藻的生長(zhǎng)抑制。

5 總結(jié)與展望

光合微生物是地球上重要的初級(jí)生產(chǎn)者，其高效的光合固碳作用為生物圈提供了近20%的有機(jī)碳。有研究還表明，光合細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、凈化水質(zhì)能力強(qiáng)，且具有增強(qiáng)動(dòng)物抗病力的功能[82]。因此，自然界中以光合微生物存在為基礎(chǔ)的混菌體系不勝枚舉。經(jīng)過(guò)數(shù)億年的進(jìn)化，獨(dú)特的生存條件使得各個(gè)混菌體系擁有自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單改良的天然混菌體系在污水處理、高價(jià)值物質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域已經(jīng)展現(xiàn)了這些天然聚生體的巨大利用價(jià)值。但是，這些天然聚生體的應(yīng)用仍舊存在一定的困難。其一，如何發(fā)現(xiàn)適應(yīng)生物工程應(yīng)用的混菌體系。自然環(huán)境中有不計(jì)其數(shù)的混菌聚生體，如何更加有效在這些混菌聚生體中找到目的體系是我們迫切需要解決的問(wèn)題。以污水處理為例，目前使用的混菌系統(tǒng)需要根據(jù)不同的菌株對(duì)污水中不同離子的處理能力進(jìn)行篩選，但篩選菌株的效率依舊非常低，因此，創(chuàng)建更好的菌株篩選方法，高通量篩選目的體系是我們需要探究的方向。其二，如何進(jìn)一步提高混菌體系的穩(wěn)定性。天然混菌體通常是在自然條件下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化形成互利共生體系，這種混菌體系具有非常高的穩(wěn)定性，但普適性與靈活性較差，這為提高人工混菌體系的穩(wěn)定性提供了一個(gè)良好的思路與解決方案。獲得共培養(yǎng)的工程菌株后，利用定向進(jìn)化的方法將工程菌株進(jìn)行馴化，避免人工構(gòu)建的混菌體系其容易崩潰的問(wèn)題。

想要更進(jìn)一步解決以上問(wèn)題，還需要我們對(duì)混菌體系之間的相互作用機(jī)理進(jìn)行深入的理解。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，一些異養(yǎng)菌可以通過(guò)改變光合微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或小分子成分來(lái)間接地影響光合微生物的基因表達(dá)，但是，我們目前對(duì)不同種群間相互作用的理論知識(shí)的理解尚顯不足。有研究表明，銅綠假單胞菌、大腸桿菌、藍(lán)細(xì)菌、枯草芽孢桿菌等其種群的細(xì)胞數(shù)量會(huì)影響到自身的某些基因的表達(dá)量[83-86]。在大腸桿菌中，Gupta等[87]已經(jīng)成功將這種群體感應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)用于工程大腸桿菌的改造，并顯著提高了目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量，如肌醇產(chǎn)量由0.23 g/L提高至1.28 g/L、葡糖二酸從不可檢測(cè)到>0.8 mg/L、莽草酸酯從不可檢測(cè)到>100 mg/L。此外，Christie-Oleza等[75]對(duì)海洋天然存在的“聚球藻-玫瑰桿菌”共生體系進(jìn)行解析時(shí)還發(fā)現(xiàn)，光合藍(lán)細(xì)菌與異養(yǎng)菌無(wú)論以何種初始接種比例接種于培養(yǎng)基，其種群數(shù)量在體系穩(wěn)定之時(shí)雙菌的數(shù)量總會(huì)維持在10︰1左右。由此我們可以猜測(cè)，除了營(yíng)養(yǎng)關(guān)系之外，是否混菌成員之間也存在著某些群體感應(yīng)系統(tǒng)，并且這種群感系統(tǒng)對(duì)雙菌和多菌的比例調(diào)控起著重要作用。相信這些問(wèn)題的解決可以使混菌體系應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域，同時(shí)對(duì)理解自然界的進(jìn)化規(guī)律也有著推動(dòng)作用。

未來(lái)，通過(guò)系統(tǒng)運(yùn)用合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、組學(xué)等研究策略，深入解析光合混菌體系種群之間的遺傳和代謝機(jī)制，對(duì)自然混菌體系進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化改進(jìn)，并構(gòu)建全新的混菌體系，相信這種技術(shù)一定會(huì)出現(xiàn)新的發(fā)展與突破。

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Recent progress in photosynthetic microbial co-culture systems

Li Zhang1,2,3, Xinyu Song1,2,3,4, Lei Chen1,2,3, and Weiwen Zhang1,2,3,4

1,,,300072,2,,300072,3,300072,4,,300072,

Co-culture systems consisted of photosynthetic microorganisms and others heterotrophic microbes have attracted great attention in recent years. These systems show many advantages when compared with single culture grown under autotrophic conditions, such as less vulnerable to pollution and more stability, thus have been applied to wastewater treatment, soil remediation, biodegradable harmful substances, and production of high value-added products. In order to explore basic theory and further applications, we summarize here recent progresses in artificial co-culture systems of using photosynthetic microorganisms, to provide a current scientific understanding for the rational design of the co-culture system based on photosynthetic microorganisms using synthetic biology.

photosynthetic microorganisms, co-culture systems, environmental engineering, cell factory, interaction

June29, 2019;

September19, 2019

Supported by: National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0903000), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31901016, 31770100, 91751102, 21621004, 31370115, 31470217, 31972931).

Xinyu Song. Tel: +86-22-27404336; E-mail: songxinyu@tju.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No. 2018YFA0903000)，國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31901016, 31770100, 91751102, 21621004, 31370115, 31470217, 31972931)資助。

10.13345/j.cjb.190288

2019-10-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190805.1059.004.html

張麗, 宋馨宇, 陳磊, 等. 光合微生物混菌體系的應(yīng)用和研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2020, 36(4): 652–665.

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(本文責(zé)編 郝麗芳)