魏濤 陳順心 黃申 錢玉梅 趙彩夢 毛多斌

關(guān)鍵詞：β-胡蘿卜素;發(fā)酵條件;香味成分;再造煙葉濃縮液

摘要：運(yùn)用單因素試驗和正交試驗，對β-胡蘿卜素降解菌株HC-3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并將最佳發(fā)酵條件下得到的菌株HC-3發(fā)酵液應(yīng)用于再造煙葉濃縮液中以研究其增香效果.結(jié)果表明：菌株HC-3發(fā)酵降解β-胡蘿卜素的最佳條件為NaNO3質(zhì)量濃度3 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度 3 g/L，初始pH值7.0，在該發(fā)酵條件下β-胡蘿卜素降解率可達(dá)93.35%.經(jīng)菌株HC-3處理后，再造煙葉濃縮液中的二氫獼猴桃內(nèi)酯、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮、9-羥基-4，7-巨豆三烯酮、檸檬酸三乙酯、4-（3-羥基丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、肉豆蔻酸和新植二烯這8種香味成分含量明顯提高;與未經(jīng)處理的再造煙葉濃縮液相比，利用菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液制得的片基香氣質(zhì)較好、香氣量較足、香氣濃度較高、雜氣量較低.

Abstract：The fermentation conditions of β-carotene degrading strain HC-3 were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment，and the fermentation liquid of strain HC-3 obtained under the optimal fermentation conditions was applied to the reconstituted tobacco concentrate to study its aroma enhancing effect.The results showed that the best fermentation conditions for β-carotene degradation were 3 g/L of NaNO3，30 g/L of sucrose，3 g/L of yeast powder and 7.0 of initial pH value.Under this condition，the degradation rate of β-carotene could reach 93.35%.After being treated by strain HC-3，the? eight flavor components of dihydroactyl lactone， 4，7，9-Mega three ene -3- keton， 4- hydroxyl -β-two hydrogen damascene，9-hydroxy-4，7-Mega three ene ketene，triethyl citrate， 4- （3-hydroxyl butyl） -3，5，5- three methyl -2- cyclohexene -1- ketone，tetradecanoic acid? and neophytadiene in the reconstituted tobacco concentrate were significantly increased.Compared with the untreated reconstituted tobacco concentrate，

0 引言

類胡蘿卜素屬于質(zhì)體色素，一般存在于葉綠體結(jié)構(gòu)內(nèi)部，由8個異戊二烯殘基單位構(gòu)成，是含40個碳原子的萜烯化合物的總稱[1-2].作為一種非常重要的天然色素，類胡蘿卜素普遍存在于水果（如檸檬、葡萄、菠蘿、橙子、草莓等）、蔬菜（如西紅柿、紅辣椒、胡蘿卜等）、鮮花（如花菱草、萬壽菊、水仙花等）、部分海洋動物、微生物和昆蟲體內(nèi)，類胡蘿卜素也是一種重要的香味前體物質(zhì)[3-4].依據(jù)分子兩端化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，類胡蘿卜素可分為β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素、ε-胡蘿卜素和其他異構(gòu)體.在煙葉調(diào)制、陳化和加工過程中，類胡蘿卜素持續(xù)的降解作用不但可以提升煙葉中性香味物質(zhì)的總量，所形成的產(chǎn)物還可進(jìn)一步經(jīng)氧化、還原、脫水等化學(xué)變化產(chǎn)生更多重要的煙草香味成分[5-6].類胡蘿卜素經(jīng)氧化作用，可分別在C9—C10，C11—C13，C13—C15等雙鍵位置發(fā)生斷裂[7-10]，生成一系列重要的煙草香味成分，如二氫大馬酮、大馬酮、二氫彌猴桃內(nèi)酯、紫羅蘭酮、環(huán)檸檬醛、氧代異氟爾酮等[11-13].

再造煙葉是利用煙草加工過程中產(chǎn)生的煙草廢棄物（煙末、碎煙片、片煙、煙梗等），經(jīng)過重新加工組合而成的煙葉替代物.其主要加工過程包括煙草原料預(yù)處理、水萃取、濃縮、制漿、抄造、涂布、干燥、后處理等.在再造煙葉生產(chǎn)過程中，煙草提取濃縮液的作用是為涂布工序提供香氣量充足且質(zhì)量穩(wěn)定、性能均一的涂布液，而涂布液的品質(zhì)又直接決定了再造煙葉產(chǎn)品的內(nèi)在品質(zhì)[14-16].目前普遍采用物理方法與化學(xué)方法制備煙草濃縮液，但存在香味物質(zhì)含量低、種類少、副產(chǎn)物較多等問題，而采用微生物技術(shù)制備煙草濃縮液，具有轉(zhuǎn)化率高、專一性高、香味物質(zhì)品質(zhì)高等優(yōu)勢，因而成為提升再造煙葉濃縮液及其制品品質(zhì)的重要方法之一.此前有人報道過β-胡蘿卜素降解產(chǎn)香菌株，但降解率較低，一般在80%以下[7-8]，也未見β-胡蘿卜素降解菌應(yīng)用于再造煙葉濃縮液的相關(guān)報道.

魏濤等[17]從再造煙葉濃縮液中篩選到一株β-胡蘿卜素降解產(chǎn)香菌株，為大腸桿菌 HC-3，初步發(fā)現(xiàn)其對于β-胡蘿卜素具有較好的降解效果.在此基礎(chǔ)上，本文擬研究β-胡蘿卜素降解菌株HC-3的最佳發(fā)酵條件，以獲得β-胡蘿卜素的最優(yōu)降解率，并進(jìn)一步對該菌株發(fā)酵液應(yīng)用于再造煙葉濃縮液的增香效果進(jìn)行研究，以期解決再造煙葉濃縮液品質(zhì)較低、利用率較低等相關(guān)技術(shù)問題.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌（Enterobacter sp.）HC-3，由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實驗室篩選與保存;β-胡蘿卜素標(biāo)樣，購于百靈威科技有限公司;β-胡蘿卜素（純度95%），購于陜西帕尼爾生物科技有限公司.

碳源：蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖;氮源：NaNO3，（NH4）2SO4，胰蛋白胨和尿素;酵母粉;以上試劑均為分析純，購于生工生物工程（上海）股份有限公司.

再造煙葉濃縮液TS-01，由河南卷煙工業(yè)煙草薄片有限公司提供.

1.1.2 主要培養(yǎng)基

無碳源培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，NaNO3 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，β-胡蘿卜素15 mg/L.

無碳源無氮源培養(yǎng)基：K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，β-胡蘿卜素15 mg/L.

1.1.3 主要儀器

7890C GC-MS色譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司產(chǎn);2600 UC/VIS紫外可見分光光度計，美國UNIC公司產(chǎn).

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素試驗

1.2.1.1 碳源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響分析方法 選取無碳源培養(yǎng)基，分別添加蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖和果糖作為碳源，調(diào)整初始pH值為7.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30 ℃條件下，搖床150 r/min培養(yǎng)24 h，通過比較不同碳源下菌株細(xì)胞干重和β-胡蘿卜素降解率，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源.將該最佳碳源分別以質(zhì)量濃度10 g/L，30 g/L，50 g/L，70 g/L和90 g/L添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，在前述條件下對菌株HC-3進(jìn)行培養(yǎng)，確定其適宜質(zhì)量濃度.

1.2.1.2 氮源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，在最佳碳源及其最佳質(zhì)量濃度的條件下，分別添加NaNO3，（NH4）2SO4，胰蛋白胨和尿素作為氮源，調(diào)整初始pH值為7.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30 ℃條件下，搖床 150 r/min 培養(yǎng)24 h，通過比較不同氮源下菌株細(xì)胞干重和β-胡蘿卜素降解率，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源.將該最佳氮源分別以質(zhì)量濃度1 g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L和 9 g/L 添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，在前述條件下對菌株HC-3進(jìn)行培養(yǎng)，確定其適宜質(zhì)量濃度.

1.2.1.3? 酵母粉質(zhì)量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，在最佳碳源、氮源及其最佳質(zhì)量濃度的條件下，調(diào)整初始pH值為7.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，將酵母粉分別以質(zhì)量濃度1 g/L，3 g/L，5 g/L，7 g/L和9 g/L添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30 ℃，搖床150 r/min條件下，對菌株HC-3培養(yǎng) 24 h，比較β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重，確定其適宜質(zhì)量濃度.

1.2.1.4 初始pH值對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，添加最佳質(zhì)量濃度的碳源、氮源和酵母粉，分別調(diào)整初始pH值至5.0，6.0，7.0，8.0和9.0，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基.在溫度30 ℃，搖床 150 r/min條件下，對菌株HC-3培養(yǎng)24 h，比較β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重，確定適宜初始pH值.

1.2.1.5 培養(yǎng)溫度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響分析方法 選取無碳源無氮源培養(yǎng)基，添加最佳質(zhì)量濃度的碳源、氮源和酵母粉，調(diào)整至最佳初始pH值，滅菌制得發(fā)酵培養(yǎng)基，分別于20 ℃，25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃和45 ℃條件下，搖床150 r/min對菌株HC-3培養(yǎng)24 h，通過比較β-胡蘿卜素的降解率和菌株細(xì)胞干重，確定適宜培養(yǎng)溫度.

1.2.2 正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取4個影響較大的因素設(shè)計L9（34）正交試驗，以確定菌株HC-3的最佳發(fā)酵條件.

1.2.3 煙支樣品的制備

將最佳發(fā)酵條件下所得菌株HC-3發(fā)酵液和再造煙葉濃縮液TS-01按1GA6FA100的體積比混合處理，在溫度為30 ℃，pH值為6.0條件下，搖床150 r/min處理72 h.

將菌株HC-3發(fā)酵液處理前和處理后的再造煙葉濃縮液按39%涂布率分別涂布至相應(yīng)片基上，在90 ℃條件下烘10 min，回潮至水分含量12.5%后切絲卷制成煙支，再將相應(yīng)煙支在溫度（22±2） ℃，相對濕度（ 60 ± 5）%的恒溫恒濕箱中平衡 48 h[18].

1.2.4 β-胡蘿卜素降解率和香味物質(zhì)含量的測定方法

采用分光光度計方法測定β-胡蘿卜素的降解率，具體方法參見文獻(xiàn)[19].采用GC-MS分析方法檢測再造煙葉濃縮液中香味物質(zhì)的含量，具體方法參見文獻(xiàn)[17].

1.2.5 感官評價方法

采用文獻(xiàn)[20]中的方法對1.2.3制備的煙支樣品進(jìn)行感官評價，以實際評吸結(jié)果來檢驗菌株HC-3發(fā)酵液對再造煙葉濃縮液處理后產(chǎn)生的效果.評價小組由15位評委組成.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 碳源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響

碳源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響如圖1所示.由圖1可知，菌株HC-3利用碳源的能力依次為：蔗糖>乳糖>麥芽糖>果糖>葡萄糖，且菌株HC-3利用蔗糖的能力明顯優(yōu)于其他碳源，β-胡蘿卜素降解率達(dá)到87.5%，菌株細(xì)胞干重達(dá)到39.2 g/L.這可能是因為蔗糖是一種非還原性雙糖，可以被菌株緩慢吸收，為其生長提供必要的碳源和能量，并確保其可以完全降解底物β-胡蘿卜素.而葡萄糖是還原性單糖，雖然其可被菌株快速吸收，但會導(dǎo)致菌株對β-胡蘿卜素的降解率降低.乳糖和麥芽糖因不易水解故不易被該菌株利用.

在確定最佳碳源為蔗糖后，繼續(xù)研究蔗糖質(zhì)量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度小于30 g/L時，菌株對β-胡蘿卜素的降解率較高;當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度大于30 g/L時，菌株對β-胡蘿卜素的降解率開始緩慢降低.這可能是因為當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度高于30 g/L 時，菌株優(yōu)先利用過量的蔗糖，導(dǎo)致β-胡蘿卜素不能很好地被降解;當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為 30 g/L 時，菌株可以正常生長并完全降解底物.因此，選擇碳源蔗糖的最佳質(zhì)量濃度為 30 g/L.

2.1.2 氮源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響

氮源對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響如圖3所示.由圖3可知，菌株HC-3在氮源為NaNO3的培養(yǎng)基中對β-胡蘿卜素降解率最高，達(dá)86.1%，同時菌株細(xì)胞干重達(dá)到39.8 g/L.在確定最佳氮源為NaNO3后，繼續(xù)研究NaNO3質(zhì)量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響，結(jié)果如圖4所示.由圖4可知，當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度低于3 g/L 時，該菌株對β-胡蘿卜素的降解率隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加而升高;當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度為 3 g/L 時，該菌株對β-胡蘿卜素的降解率最高;當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度高于3 g/L 時，該菌株對β-胡蘿卜素的降解率呈下降趨勢.這可能是因為氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，pH升高，代謝產(chǎn)物積累困難.因此，選擇氮源NaNO3的最佳質(zhì)量濃度為3 g/L.

2.1.3 酵母粉質(zhì)量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響

酵母粉質(zhì)量濃度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響如圖5所示.由圖5可知，酵母粉對β-胡蘿卜素降解速率的影響非常明顯，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度低于3 g/L 時，菌株對β-胡蘿卜素的降解能力最高;之后，降解率隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加而顯著下降;當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為 9 g/L時，菌株生長最好，但是對底物的降解能力最低.因此，選擇酵母粉的最佳質(zhì)量濃度為3 g/L.

2.1.4 初始pH值對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響

微生物機(jī)體內(nèi)的反應(yīng)一般都是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)都會有一個最適的pH值范圍.初始pH值對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響如圖6所示.由圖6可知，發(fā)酵液的初始pH值對β-胡蘿卜素降解率影響極大，在初始pH值小于7.0時，菌株HC-3對β-胡蘿卜素的降解能力隨pH值的增大而增大;當(dāng)初始pH值大于7.0時，菌株HC-3對β-胡蘿卜素的降解率緩慢下降.因此，選擇最佳初始pH值為7.0.

2.1.5 培養(yǎng)溫度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響

微生物不同的生理活動均要求相應(yīng)的溫度，溫度不僅影響酶活還能夠影響酶促反應(yīng)速率.培養(yǎng)溫度對β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響如圖7所示.由圖7可知，溫度在35 ℃ 時，降解率達(dá)到最高，菌株細(xì)胞干重較高，因此，選擇最適培養(yǎng)溫度為35 ℃.

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取4個影響較大的因素，即蔗糖質(zhì)量濃度（A）、NaNO3質(zhì)量濃度（B）、酵母粉質(zhì)量濃度（C）和初始pH值（D），設(shè)計L9（34）正交試驗，正交試驗因素水平如表1所示，正交試驗結(jié)果如表2所示.由表2可知，影響β-胡蘿卜素降解率的因素主次為C>B>A>D，即酵母粉質(zhì)量濃度>NaNO3質(zhì)量濃度>蔗糖質(zhì)量濃度>初始pH值.降解率方差分析結(jié)果如表3所示.由表3可知，酵母粉質(zhì)量濃度對β-胡蘿卜素降解率影響顯著.菌株 HC-3的最佳發(fā)酵條件為A3B2C2D1，即蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L，NaNO3質(zhì)量濃度3 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度3 g/L，初始pH值7.0.經(jīng)驗證，在此最佳發(fā)酵條件下，菌株HC-3對β-胡蘿卜素的降解率為93.35%.

2.3 再造煙葉濃縮液處理前后的香味成分分析

以菌株HC-3處理前的再造煙葉濃縮液為對照組、菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液為實驗組，菌株HC-3處理前后再造煙葉濃縮液香味成分的變化如表4所示.由表4可知，菌株HC-3處理前后再造煙葉濃縮液中共有46種香味成分發(fā)生變化，其中8種主要香味成分含量明顯提高，分別為二氫獼猴桃內(nèi)酯（提高0.616%）、4，7，9-巨豆三烯-3-酮（提高 0.765%）、4-羥基-β-二氫大馬酮（提高 0.933%）、9-羥基-4，7-巨豆三烯酮（提高 2.730%）、檸檬酸三乙酯（提高0.535%）、4-（3-羥基丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮（提高0.071%）、肉豆蔻酸（提高0.517%）和新植二烯（提高9.177%）.

2.4 感官評吸結(jié)果

再造煙葉濃縮液處理前后的評吸效果如表5所示.由表5可知，與未處理的再造煙葉濃縮液相比，經(jīng)菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液綜合得分提高0.7分，所得片基香氣質(zhì)較好、香氣量較足、香氣濃度較高、雜氣量較低.

3 結(jié)論

本文運(yùn)用單因素試驗和正交試驗，對β-胡蘿卜素降解菌株HC-3的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并將最佳發(fā)酵條件下得到的菌株HC-3發(fā)酵液應(yīng)用于再造煙葉濃縮液，結(jié)合感官評吸考察該菌株的增香效果.結(jié)果表明：菌株HC-3發(fā)酵降解β-胡蘿卜素的最佳條件為NaNO3質(zhì)量濃度3 g/L，蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度3 g/L，初始pH值7.0，在該發(fā)酵條件下β-胡蘿卜素降解率可以達(dá)到93.35%.經(jīng)該菌株處理后，再造煙葉濃縮液中的二氫獼猴桃內(nèi)酯、4，7，9-巨豆三烯-3-酮、4-羥基-β-二氫大馬酮、9-羥基-4，7-巨豆三烯酮、檸檬酸三乙酯、4-（3-羥基丁基）-3，5，5-三甲基-2-環(huán)己烯-1-酮、肉豆蔻酸和新植二烯這8種香味成分含量明顯提高;與未處理再造煙葉濃縮液相比，經(jīng)菌株HC-3處理后的再造煙葉濃縮液制得的片基香氣質(zhì)較好、香氣量較足、香氣濃度較高、雜氣量較低，綜合得分提高了0.7分.該β-胡蘿卜素降解產(chǎn)生致香物質(zhì)的新技術(shù)有助于提高再造煙葉濃縮液品質(zhì)和利用率，也為我國再造煙葉生物增香提供了一種新的途徑和方法.

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