柳芬芳 李迎秋

關鍵詞：綠豆蛋白;響應面法;堿提酸沉法

摘要：以綠豆為原料，采用堿提酸沉法提取綠豆蛋白，通過單因素試驗研究綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比、提取溫度、提取時間和pH值對綠豆蛋白提取率的影響，并通過響應面法優(yōu)化綠豆蛋白的提取工藝.結果表明：綠豆蛋白的最佳提取工藝條件為綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比1GA6FA15，提取溫度40 ℃，提取時間20 min，pH值9.0，該條件下綠豆蛋白的最大提取率可達88.80%.

Abstract：With mung bean as raw material，alkaline-extraction method was used to obtain mung bean was made by proteins.The effect of mung bean flour and distilled water mass ratio， extraction temperature， extraction time and pH value on the mung bean protein extraction rate were studied by single factor experiment.Optimization of protein extraction from mung bean was made by using response surface methodology.The results showed that the optimum extraction conditions for mung bean protein were the ratio between mung bean flour and distilled water mass 1GA6FA15 ， extraction temperature 40 ℃， extraction time 20 min and pH value 9.0.Under these conditions， the maximal extraction rate of mung bean protein was 88.80%.

0 引言

綠豆，又稱青小豆，是重要的豆科植物，世界各地廣泛種植.綠豆有黃色、青色、褐色3種顏色，其種皮分為有光澤和無光澤兩種類型.根據(jù)綠豆種皮的色澤，又可以劃分為明綠豆、雜綠豆、灰綠豆、黃綠豆4種類型[1].綠豆的食用價值很高，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，價格低廉，幾千年來，一直是中國百姓餐桌上的常見食品[2].綠豆含有多種營養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物和氨基酸，其中，綠豆蛋白的氨基酸譜顯示其可以滿足人體對氨基酸的需求[3].綠豆含有20%以上的蛋白質(zhì)和60%以上的碳水化合物，其中綠豆蛋白作為植物來源的蛋白質(zhì)，是豆類所含成分中僅次于淀粉的第二大成分[4-5].據(jù)報道，綠豆蛋白是一種重要的生物活性蛋白[3].然而在亞洲，目前從綠豆中提取的產(chǎn)物主要是淀粉而非蛋白質(zhì).在綠豆加工中，蛋白質(zhì)作為副產(chǎn)物被丟棄，造成資源的浪費.隨著糧食安全問題日益凸顯，以及動物源性蛋白質(zhì)成本上漲帶來的壓力，人們對天然植物源性蛋白質(zhì)的關注度不斷增強，開發(fā)綠豆蛋白以緩解我國植物源性蛋白緊缺的現(xiàn)狀，豐富我國植物源性蛋白資源，具有重要意義.

提取植物蛋白最常用的一種方法是堿提酸沉法[6-7]，此外還有酶解法、超濾法等[8-14].酶解法提取植物蛋白的催化效率高，但由于其成本高，對劑量要求高，因此不適用于工業(yè)化生產(chǎn).超濾法具有操作簡單、成本較低的優(yōu)點，但其更適用于植物蛋白的純化而非提取.堿提酸沉法的優(yōu)點是蛋白質(zhì)溶出率較高，操作簡單，成本低，但也有缺點，即堿液濃度過大時，易發(fā)生美拉德反應，使蛋白質(zhì)溶液顏色加深，從而影響其營養(yǎng)特性[15].盡管如此，與酶解法、超濾法相比，堿提酸沉法仍是更適用于植物蛋白提取工業(yè)化生產(chǎn)的方法.L.U.Thompson[16]第一次根據(jù)蛋白質(zhì)可在等電點時沉淀的特性，使用堿提酸沉法將綠豆中的蛋白提取出來.隨后，R.N.Adsuale[17]對提取的綠豆分離蛋白作了營養(yǎng)方面的綜述.劉詠等[18]對以水作為提取劑提取綠豆粉中蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件進行了優(yōu)化.響應面法是一種應用廣泛的試驗優(yōu)化方法，可以快速高效地確定存在多影響因子系統(tǒng)的最佳條件，已在多種優(yōu)化實踐中得到應用[19].

然而，利用響應面法優(yōu)化綠豆蛋白的提取工藝卻鮮有報道.

鑒于此，本文擬通過堿提酸沉法提取綠豆蛋白，采用單因素試驗和響應面優(yōu)化以獲得綠豆蛋白的最佳提取工藝，以期充分開發(fā)植物源性蛋白，促進綠豆蛋白資源的利用，進而為綠豆蛋白提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

綠豆，購于山東省家家悅超市;NaOH，分析純，天津市鼎盛鑫化工有限公司產(chǎn);磷酸，HCl，95%乙醇，

均為分析純，

國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn);考馬斯亮藍，美國Sigma公司產(chǎn).

1.2 儀器與設備

AL 204型

分析電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn);DK-98-IIA型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市金南儀器廠產(chǎn);HX-100型高速粉碎機，浙江省永康市溪岸五金藥具廠產(chǎn);SC-242D型立式冷藏展示柜，青島海爾股份有限公司產(chǎn);TG16-WS型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn);手動單道可調(diào)式移液器，北京大龍醫(yī)療設備有限公司產(chǎn);GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn);Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀，廣州賽為思儀器設備有限公司產(chǎn);PB-10標準型pH計，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產(chǎn);Scientz-18N型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn);721型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn).

1.3 實驗方法

1.3.1 綠豆蛋白的提取 綠豆經(jīng)過除雜后，用水清洗干凈，放入鼓風干燥箱內(nèi)烘干，用高速粉碎機將綠豆磨成粉，過60目篩;用電子天平稱取1.000 g綠豆粉，按照一定的質(zhì)量比加入蒸餾水，攪拌，使之混合均勻，并用 1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值;將混合均勻的綠豆粉溶液放在特定溫度的恒溫水浴鍋中保溫一段時間，冷卻至室溫后，以 4000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，過濾;取過濾后的上清液，用 1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)其pH值至 4.0，以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄去上清液，將沉淀反復水洗至中性，加少量蒸餾水復溶，經(jīng)過冷凍干燥后，即得綠豆蛋白，儲存于 4 ℃ 冰箱中備用.

1.3.2 綠豆蛋白提取率的測定 綠豆蛋白提取率的計算公式為綠豆蛋白提取率=提取液中蛋白質(zhì)含量綠豆中總蛋白含量×100%式中，提取液中的蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法[20]進行測定，綠豆中的總蛋白含量采用凱氏定氮法[21]測定，蛋白質(zhì)的換算系數(shù)為6.25.

1.3.3 單因素試驗 在前期實驗的基礎上，選擇4種對綠豆蛋白提取率有影響的因素，即綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比 （1GA6FA5，1GA6FA10，1GA6FA15，1GA6FA20，1GA6FA25） 、pH值 （8.0，8.5，9.0，9.5，10.0） 、提取時間 （10 min，20 min，30 min，40 min，50 min） 和提取溫度 （20 ℃，30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃），進行單因素試驗，分別測定各相關單因素對綠豆蛋白提取率的影響.

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎上，選擇綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）和pH值（X4）4個因素為響應面優(yōu)化試驗中的關鍵因素，以綠豆蛋白質(zhì)提取率（Y）為響應值，進行綠豆蛋白提取工藝條件的優(yōu)化.響應面自變量因素編碼和水平見表1.

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

每個樣品重復進行3次試驗，所得數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010軟件處理并繪圖，采用Design Expert 8.0.6.1軟件對響應面試驗數(shù)據(jù)進行分析.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比對綠豆蛋白提取率的影響 在pH值為9.0，提取溫度為 40 ℃，提取時間為20 min的條件下，綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比對綠豆蛋白提取率的影響如圖1所示.由圖1可知，隨著綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比的減小，綠豆蛋白的提取率呈先增大后減小的趨勢.當綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比較大時，綠豆蛋白提取率增加的幅度較大，隨著綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比的繼續(xù)減小，綠豆蛋白的提取率增幅較小.這可能是因為隨著綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比的減小，溶質(zhì)體系分布得更加均勻，有利于蛋白質(zhì)的充分溶解[22].當綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比達到 1GA6FA15 時，綠豆蛋白的提取率開始呈現(xiàn)減小的趨勢，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是因為隨著加水量的增大，提取液中蛋白質(zhì)濃度的降低以及其他小顆粒物質(zhì)的溶解[23]，使得綠豆蛋白的提取率減小.由此可知，當綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比為1GA6FA15時，綠豆蛋白提取率可達到最大值（為 88.88%），可將該質(zhì)量比作為響應面試驗設計的中心值.

2.1.2 pH值對綠豆蛋白提取率的影響 在溫度為40 ℃，綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比為1GA6FA15，提取時間為20 min的條件下，pH值對綠豆蛋白提取率的影響如圖2所示.由圖2可知，隨著pH值的增大，綠豆蛋白的提取率呈先增大后減小的趨勢.當pH值低于9.0時，綠豆蛋白的提取率隨著pH值的增大而增大，這主要是因為在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力比較大[24]，有利于蛋白質(zhì)與水分子相互作用，蛋白質(zhì)溶解度增加，導致蛋白質(zhì)的提取率也增大.當pH值達到9.0后，若進一步增大pH值，綠豆蛋白的提取率趨于平緩減小的狀態(tài)，這主要是因為pH值過大會改變蛋白質(zhì)表面的電荷分布狀態(tài)，從而增加蛋白質(zhì)的水溶性，即增加了水溶性蛋白含量.在高pH值條件下，綠豆蛋白的顏色也會進一步加深，這是因為發(fā)生了美拉德反應，而美拉德反應產(chǎn)生的黑褐色物質(zhì)類黑精還會導致蛋白質(zhì)的變性和營養(yǎng)功能的喪失[25].綜合上述情況考慮，選取pH 值為 9.0作為響應面試驗設計的中心值.

2.1.3 提取時間對綠豆蛋白提取率的影響 在溫度為40 ℃，綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比為1GA6FA15，pH值為9.0的條件下，提取時間對綠豆蛋白提取率的影響如圖3所示.由圖3可知，當提取時間從10 min增加到20 min時，綠豆蛋白的提取率增幅很大，并且在20 min時，綠豆蛋白的提取率達到最大值（為88.80%）.隨著提取時間的進一步延長，綠豆蛋白的提取率出現(xiàn)減小的趨勢，并逐漸趨于穩(wěn)定.剛開始提取時，綠豆蛋白的提取率較低，這可能是因為起初蛋白質(zhì)與水混合不充分，導致只有較少的一部分蛋白質(zhì)分子與水分子發(fā)生相互作用;隨著提取時間的延長，蛋白質(zhì)分子結構逐漸伸展、無序，導致更多的親水基團暴露出來[26]，蛋白質(zhì)的溶解度增大，從而提高了提取率.綠豆蛋白的提取率達到最大值后，若繼續(xù)延長提取時間，提取率開始減小，這是由于長時間的堿性環(huán)境導致蛋白質(zhì)發(fā)生變性繼而生成沉淀[27]，以致綠豆蛋白的提取率減小.綜合上述情況考慮，選取提取時間20 min作為響應面試驗設計的中心值.

2.1.4 提取溫度對綠豆蛋白提取率的影響 在綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比為1GA6FA15，pH值為9.0，提取時間為20 min的條件下，提取溫度對綠豆蛋白提取率的影響如圖4所示.由圖4可知，當提取溫度從20 ℃提高到40 ℃時，綠豆蛋白的提取率明顯增大;當提取溫度為40 ℃時，綠豆蛋白的提取率達到最大值（為88.88%）;當提取溫度進一步升高，綠豆蛋白的提取率出現(xiàn)減小的趨勢.綠豆蛋白的提取率隨著溫度的升高而增大，可能是由于溫度的升高使水分子和蛋白質(zhì)分子的相互作用增強，提高了蛋白質(zhì)的溶解度，從而使蛋白質(zhì)的提取率增大.但是隨著溫度的進一步提高，會導致蛋白質(zhì)的變性和蛋白質(zhì)顏色的加深[28]，從而使綠豆蛋白的提取率減小，造成綠豆蛋白營養(yǎng)物質(zhì)的損失.綜合上述情況考慮，選取提取溫度40 ℃為響應面試驗設計的中心值.

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果分析

綠豆蛋白提取率的響應面試驗設計方案和結果見表2.

利用Design Expert 8.0.6.1響應面軟件對表2的試驗結果進行回歸分析，得到綠豆蛋白提取率對綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比、提取溫度、提取時間和pH值四因素的二次多項回歸方程，即對綠豆蛋白提取率的回歸模型方差的分析見表3.

從表3可知，模型的P<0.000 1，表示采用堿提酸沉法提取綠豆蛋白的回歸模型極其顯著.與此同時，回歸模型的一次項X1（綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比）是顯著的，二次項X12，X22，X32和X42是極顯著的;交互項X1X2，X1X3，X2X4，X3X4是極顯著的，X2X3是顯著的，X1X4是不顯著的.從以上分析結果可知，綠豆蛋白提取率的二次多項回歸模型顯著，各因素對綠豆蛋白提取率的影響是一種復雜的關系，各個因素中提取溫度、綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比是影響綠豆蛋白提取率的重要因素.失擬項P為0.583 3是不顯著的，相關系數(shù) R2 =0.985 4，說明模型擬合程度好，該二次多項回歸模型可以較好地分析和預測綠豆蛋白的提取率.

根據(jù)綠豆蛋白提取率的回歸方程，利用Design Expert 8.0.6.1響應面分析軟件繪制各因素交互作用的響應曲面圖和等高線圖，如圖5所示.圖5顯示的是一種因素水平為0時，另外兩因素對綠豆蛋白提取率的交互作用：3D曲面坡度越大，兩因素相互作用影響越顯著;等高線圖的橢圓離心率越大，兩因素相互作用效果越大.由圖5可看出，各等高線均為橢圓形，其中，圖5c）的曲面傾斜程度最大，說明綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比與提取時間、綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比與提取溫度、提取溫度與pH值、提取時間與pH值的交互作用對綠豆蛋白提取率的影響極顯著，而提取溫度與提取時間交互作用的影響是顯著的，綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比與pH值交互作用的影響不顯著.

響應面優(yōu)化回歸模型結果表明，當綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比為1GA6FA14.5，提取溫度為 38.9 ℃，提取時間為19.2 min，pH值為 8.9時，理論上綠豆蛋白提取率的最大值為 87.24%.為了便于試驗操作，將優(yōu)化得到的綠豆蛋白提取工藝條件修正為綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比 1GA6FA15，提取溫度40 ℃，提取時間20 min，pH值9.0.

2.3 響應面優(yōu)化模型的驗證結果分析

為了檢驗響應面試驗所得到的綠豆蛋白提取率模型的正確性和合理性，重新進行了一組驗證試驗.在綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比為1GA6FA15，提取溫度為40 ℃，提取時間為20 min，pH值為9.0的條件下，綠豆蛋白的提取率為88.80%.由此可知，綠豆蛋白提取率驗證試驗的結果與模型預測值之間沒有很大的差異 （P>0.05），說明了響應面設計得到的模型可以較準確地分析和預測綠豆蛋白的提取率.

3 結論

本文采用堿提酸沉法提取綠豆中的蛋白質(zhì)，

通過單因素試驗研究了綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比、提取溫度、提取時間和pH值對綠豆蛋白提取率的影響，并通過響應面法優(yōu)化了綠豆蛋白的提取工藝.

結果表明：綠豆蛋白的最佳提取工藝條件為綠豆粉與蒸餾水質(zhì)量比 1GA6FA15，提取溫度40 ℃，提取時間20 min，pH值 9.0，在此條件下綠豆蛋白可獲得最大提取率（為 88.80%）.該研究為綠豆蛋白提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的技術參考，對綠豆蛋白的開發(fā)和綠豆活性物質(zhì)的研究有一定的促進作用.

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