李解　唐敏　翟秀明　侯渝嘉

摘? ?要? ?與其他植物組織培養(yǎng)的快速發(fā)展相比，茶樹組織培養(yǎng)至今仍未建立完善的高頻再生體系，究其原因，主要是茶樹組織培養(yǎng)過程中常會出現褐變、黃化、玻璃苗、畸形、污染等問題?；诖?，綜述了目前茶樹組織培養(yǎng)中的常見問題及其防治措施，并展望了茶樹組培的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

關鍵詞? ?茶樹;組織培養(yǎng);褐化;超度含水態(tài)

中圖分類號：S571.1? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.7.014

在茶樹種質資源保存、新品種選育及種性改良等方面，茶樹組培技術具有打破種屬界限、克服遠緣雜交不親和等問題的優(yōu)勢。茶樹組培技術從最初的以幼莖材料研究離體咖啡堿的合成[1]，到以茶樹子葉、花藥為材料誘導分化獲得再生植株[2-3]，再到目前以不同器官為外植體獲得植株[4-7]，其技術取得了顯著提高。茶樹為多年生木本植物，生長速度慢，增殖率、成苗率較低，在組培工作中常會出現褐變、黃化、玻璃苗、畸形胚、污染等問題，這既影響組培實驗結果，甚至導致實驗失敗，也阻礙了組培快繁技術的應用。為此，本文就目前茶樹組織培養(yǎng)應用過程中的常見問題及其防治措施進行綜述，旨在為茶樹組培技術優(yōu)化、茶樹新品種選育及種質資源保存等方面的研究提供參考。

1 茶樹組培中的褐化問題

1.1 外植體的選擇與切割方式

茶樹為木本植物，其植物體內多酚類物質含量較高，外界物理損傷破碎細胞后，酚類物質開始發(fā)生氧化作用，導致茶樹外植體在組培過程中褐化現象顯著。因此，茶樹外植體的選擇與切割方式會直接影響外植體褐化程度。有研究表明，茶樹外植體褐化程度一般隨著材料的嫩度、組織木質化程度的提高及外植體受傷害程度的增加而加深。黃皓等[8]在誘導茶樹愈傷組織選擇外植體研究中發(fā)現，隨著材料嫩度的降低（茶樹莖段→葉片→種子），外植體褐化程度降低而誘導率增高。黃燕芬等[9]在3種橫切方式對外植體褐變和腋芽萌動生長影響研究表明，腋芽葉片橫切后保留2/5與保留1/2、保留整個帶腋芽葉片相比，腋芽萌動生長狀況最好，褐化程度居中。張志蘭[10]研究發(fā)現，經過消毒的山茶花莖段外植體剪去一段莖段接入培養(yǎng)基，會一定程度上降低褐化現象，表明盡量縮短外植體傷口與氧的接觸時間能夠較大程度地減少褐化危害。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

植物的基礎培養(yǎng)基種類較多，如MS、N6等，因各類培養(yǎng)基內所含成分不同，其組培褐變程度影響也有差異。目前茶樹組培中最常見的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，具有無機鹽含量高、微量元素豐富等特點;但有研究者通過提高培養(yǎng)基內無機鹽含量實驗發(fā)現，伴隨無機鹽濃度的增加，多酚類物質的產生加快，外植體褐變程度加重[11]。成浩等[12]在研究大量元素對于莖段生長影響的研究中發(fā)現，培養(yǎng)基大量元素減半能夠很好的降低莖段的褐變程度，同時也促進了莖段的誘導和生長。趙瑋[13]就鐵鹽濃度對于茶樹組培中茶樹莖段與愈傷組織的影響研究結果表明：培養(yǎng)基內鐵鹽濃度的加大，二者褐化程度都逐漸增高，其中以對照組與0.25倍鐵鹽濃度褐變程度較低，而以生長表現來說，0.5倍鐵鹽在茶樹組培過程中表現最好。

1.3 消毒時間及方式

目前，植物組培過程中滅菌劑與消毒方式的選擇較多，茶樹組培中常用的滅菌劑為酒精、升汞、次氯酸鈉等，通常選擇70%～75%酒精和0.1%～0.2%升汞進行外植體消毒。有研究表明，通過加長外植體消毒時間，能都達到更好的消毒效果，但褐變程度會加重[14];因此，在茶樹組培過程中能夠將污染率和褐化率都降低到低水平比較困難，同時證明，通過控制消毒時間來降低外植體褐變程度的操作較為困難。也有研究認為，外植體消毒后清洗不徹底是導致其褐變程度嚴重的原因之一，姚永宏[15]在研究不同滅菌方式對褐化程度的影響研究中發(fā)現，通過對比不同的滅菌方式其褐變程度差異不顯著，但在清洗方式上，磁力攬拌清洗方式的褐變程度顯著低于手搖和靜止的清洗方式。

1.4 植物生長調節(jié)劑

植物組培中常用的生長調節(jié)劑主要包括生長素類（2，4-D、IBA等）、細胞分裂素（6-BA、KT等）、脫落酸（ABA）、GA3等。闕生全等[16]在生長素類調節(jié)劑對于外植體誘導生長及褐化影響的試驗中發(fā)現，高濃度的2，4-D會刺激外植體褐化時間提早，褐化率增高，褐變程度加深，導致外植體死亡，同時也會降低愈傷組織的誘導率。黃燕芬等[9]研究發(fā)現，不同濃度6-BA對于外植體褐變程度影響不同，在高濃度6-BA條件下的外植體褐化率極顯著高于低濃度，同時發(fā)現低濃度條件下的6-BA不僅褐變反應慢，更適宜外植體莖尖的分化生長。此外，秦廷豪等[17]研究發(fā)現通過含不同濃度生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基交替培養(yǎng)可降低繼代培養(yǎng)中的多酚危害。

1.5 抗氧化劑和吸附劑的應用

植物組培過程中不同抗氧化劑和吸附劑的使用也不同程度地影響外植體褐化。目前，茶樹組培中常見的抗氧化劑和吸附劑有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）、抗壞血酸（VC）等。張亞萍等[18]通過對比浸泡與沒有浸泡過VC的莖段、芽尖的褐變程度發(fā)現，浸泡過VC的莖段、芽尖的褐化程度都明顯降低。闕生全等在研究各種配比抗氧化劑和吸附劑培養(yǎng)基對于外植體褐化影響實驗中發(fā)現，在控制褐變效果上，以添加吸附劑（AC和PVP）的控制效果最好，在添加抗氧化劑的培養(yǎng)基中表現為褐變程度較為嚴重，其中以添加Na2S2O3最為嚴重。然而就外植體愈傷組織生長勢來看，添加VC的培養(yǎng)基要優(yōu)于添加吸附劑的培養(yǎng)基。因此，在培養(yǎng)基中添加少量適宜濃度的抗氧化劑和吸附劑，可以在控制褐變反應的同時促進外植體生長。

2 茶樹組培中的黃化、畸形問題

2.1 培養(yǎng)基中礦物質營養(yǎng)不均衡

培養(yǎng)基中礦物質營養(yǎng)不均衡、生長調節(jié)劑配比不當、瓶內乙稀等次生代謝物含量增高、光照不足、溫度不適等因素都可能導致茶樹組培苗黃化、畸形現象的產生。有研究表明，N、S、Mg、Fe、Mn、Cu、B、Zn是植物生長所必需的營養(yǎng)元素，植物正常生長發(fā)育過程中，當某一種元素缺失表現為不足時，其他元素會因最低因子律的制約導致其含量再多也無法發(fā)揮作用，植物本身出現失綠癥[19]。主要表現為：N缺乏，葉色變淡，乃至黃色，植株矮小，瘦弱;S缺乏，新葉失綠黃化;Mg缺乏，中下部葉脈間失綠黃化;缺Mn，茶樹葉片發(fā)黃，嚴重時出現褐斑、干枯脫落;缺B、Zn，節(jié)間縮短，葉片失綠畸變，有簇生現象，生長緩慢;缺Cu，葉片細胞失去膨壓呈萎凋狀態(tài)，葉薄色淺，嚴重時全株大量落葉;缺Fe，頂芽淡黃，嫩葉花白色，嚴重時葉片呈白色、枯死[20]。姚元濤等[21]在山東棕壤茶園幼齡茶樹葉片黃化病因診斷與防治的研究中發(fā)現，Mn、Cu、Zn在茶樹葉片葉綠素形成過程中表現為某些酶的活化劑，是葉片中葉綠素含量高低和葉綠體結構完整性的重要調節(jié)元素。黃萍等[22]在4種因子對于馬鈴薯莖尖培養(yǎng)黃化影響的研究中發(fā)現，Mg、N、Fe在適宜濃度條件下都具有顯著抑制黃化苗發(fā)生的作用，但濃度過高或過低的Mg和N會導致黃化率的增高，而在高濃度下Fe鹽會顯著降低黃化苗的發(fā)生。

2.2 生長調節(jié)劑配比不當

生長調節(jié)劑是組織培養(yǎng)中非常關鍵的一類成分，需要根據培養(yǎng)目標給予適合的配比，過高或過低均會影響組培苗的生長。史俊等[23]研究表明，在低生長調節(jié)劑水平下，碧云茶樹組培苗生長勢較好、葉色深綠，但隨著生長調節(jié)劑濃度的提高，組培苗葉片開始發(fā)黃、生長勢變弱，嚴重時出現死亡。黃華艷等[24]研究表明，通過交替使用不同高低濃度的細胞分裂素和生長素，組培苗的生長效果更顯著。而張文珠等[25]在麗格海棠的組織培養(yǎng)實驗中也發(fā)現，交替使用最適培養(yǎng)基與無生長調節(jié)劑MS培養(yǎng)基相較于一直使用同一種培養(yǎng)進行繼代培養(yǎng)，組培苗生長勢更好。

2.3 乙烯等次生代謝物含量增高

乙烯是培養(yǎng)物在密閉環(huán)境中進行生理代謝活動時產生與積累，對植物組織的影響有利有弊，其負面影響包括抑制芽的分化、阻礙植物成長和促進老化[26]。華智銳等[27]在研究不同濃度活性炭與黃芩組培苗黃化現象的關系實驗中發(fā)現，通過在培養(yǎng)基加入活性炭能夠顯著降低黃芩組培苗黃化率，二者呈負相關關系，當培養(yǎng)基中活性炭含量由0.5 g·L-1提高到1g·L-1時，黃芩組培黃化率降低幅度最大，為30%下降到9%。研究者認為活性炭作為吸附劑，能夠有效地吸附黃芩組培苗生長過程中產生的乙烯等代謝產物，從而平衡培養(yǎng)基中各種生長調節(jié)劑，穩(wěn)定pH值，保障了組培苗的正常生長。

2.4 類菌原體

植原體，原稱類菌原體，為單細胞原核生物，無細胞壁，由生物膜包圍，專性寄生于植物的韌皮部篩管系統[28]，可引起植物病害，如枝葉簇生成團，似茶樹缺鋅癥狀，黃化，新生葉細小硬化，節(jié)間縮短，花器變態(tài)，生長衰退甚至枯死等，且篩管內往往有多量愈傷組織增生[29]。與黃化病有關的植原體最早在美國翠菊植株上發(fā)現的[30]。在茶樹上，植物菌原體黃化病害于早年在云南省保山茶區(qū)發(fā)現[31]。目前，對于該病害的防治，還未發(fā)現經濟、高效、環(huán)保的藥物。

3 超度含水態(tài)

植物組織培養(yǎng)過程中，組培苗會出現矮小膨脹失去綠色、新梢或葉片表現為透明或半透明狀、葉片質脆而卷曲的生長異?，F象，這種試管苗生長異?，F象為組培苗“玻璃化”，于1981年Debergh首次命名[32]，1990年改用“超度含水態(tài)”。該現象是植物組培過程中的一種特有的生理失調或生理病變，由培養(yǎng)條件中的多種因素相互作用導致組培苗細胞內新陳代謝紊亂所致。這些生長異常的組培苗，一般光合能力與酶活性都較低，器官功能不全，組織畸形，難以增殖分化、生根成苗，通常不會選擇作為繼代培養(yǎng)和擴繁的材料[33]。

玻璃苗的發(fā)生與培養(yǎng)基中的瓊脂和蔗糖濃度偏低、離子種類或濃度不當、以及培養(yǎng)溫濕度和光照等有關。張燕玲等[34]在絲石竹的玻璃化現象實驗中發(fā)現，一定濃度條件下，絲石竹組培苗的玻璃化率與蔗糖含量呈負相關，培養(yǎng)基中蔗糖含量的增加會降低絲石竹組培苗玻璃化的發(fā)生。而龔明霞等[35]也在洋桔梗玻璃化苗的研究中發(fā)現，通過在培養(yǎng)基中加入適宜濃度的蔗糖能夠促進洋桔梗組培苗玻璃化性狀的恢復。因此，為降低植物組培中玻璃化苗的產生，可從外植體選擇和培養(yǎng)基選擇，增加瓊脂、蔗糖用量及Zn2+、Ca2+等離子濃度等方面著手。

4 展望

茶樹組培在茶樹種質資源保存、新品種的選育及種性改良等研究方面具有重要作用。今后茶樹組培的研究工作，需要加強各類生長調節(jié)劑的調控作用研究，完善對珍稀茶樹資源的離體保存，豐富茶樹種質資源，重點研究開發(fā)茶樹組培與轉基因技術相結合的新方法，設計建立更優(yōu)的茶樹組培苗轉化體系技術，實現目標基因的轉移，最終培育出具有特、異、優(yōu)性狀的茶樹新品種。

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（責任編輯：敬廷桃）

收稿日期：2019-11-30

作者簡介：李解（1991—），男，重慶墊江人，碩士，研究實習員，主要從事茶樹育種?！鶠橥ㄐ抛髡?，E-mail： 617393574@qq.com。