王慧娟，吳正奇，葉文祥，蔣園園，萬端極*

1. 湖北工業(yè)大學(xué)土木建筑與環(huán)境學(xué)院（武漢 430068）；2. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院（武漢 430068）

牡丹，古稱木芍藥，屬毛莨科芍藥屬灌木多年生木本植物。牡丹根（丹皮）是重要的中藥材，眾多近代藥理研究表明丹皮具有消炎、提高免疫力、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用。同時(shí)，牡丹籽富含豐富的油脂和蛋白，自2011年3月22日中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)（原中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部）批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品起，近年來受到頗多關(guān)注。油用牡丹是指牡丹組植物中，籽出油率不低于22%的種的統(tǒng)稱[1]。劉建華等[2]和王昌濤等[3]均采用正己烷提取牡丹籽油后分析其脂肪酸組成，一致表明不飽和脂肪酸含量約達(dá)到90%，其主要成分亞麻酸和亞油酸分別超過了56%和28%。且亞麻酸和亞油酸是人體不能合成，只能通過食物獲得的必需脂肪酸。毛程鑫等[4]的研究表明，牡丹籽油中維生素E的含量達(dá)到了56 mg/100 g。Sarker等[5]發(fā)現(xiàn)牡丹籽中含有芪類和黃酮類。同時(shí)，王蕓[6]對(duì)牡丹籽油的小鼠急性毒性試驗(yàn)表明，牡丹籽油屬無毒級(jí)食物、無至畸作用。董振興等[7]研究牡丹籽油對(duì)高血脂癥大鼠、糖尿病小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)其具有降低血脂和血糖的作用。截至目前為止，我國(guó)油用牡丹種植面積已達(dá)到2萬 hm2左右，其適種范圍廣，且林下荒坡均可種植。然而，我國(guó)食用植物油約有63%依賴進(jìn)口[8]，大力發(fā)展牡丹籽油，對(duì)于緩解這一現(xiàn)狀極具重要意義。

目前牡丹籽油的提取，現(xiàn)已有報(bào)道的有壓榨法、溶劑法、超臨界CO2萃取法、水酶法。然而，傳統(tǒng)的壓榨法機(jī)械耗能大、餅粕殘油率高，且高溫高壓過程容易產(chǎn)生致癌物苯并芘；溶劑法提油，成品油中會(huì)有微量溶劑殘留，于人體和環(huán)境都會(huì)造成一定危害；超臨界CO2萃取法雖然提油率高、沒有引入有機(jī)溶劑，但其設(shè)備高昂，工業(yè)化的普及受到了極大的限制；已有的水酶法工藝大多采用多酶體系，其游離油提取率較低、酶解離心后形成較厚的乳化層，因而工業(yè)化成本高昂。試驗(yàn)采用水酶法提取牡丹籽油，在酸熱法預(yù)處理牡丹籽仁的基礎(chǔ)上，使用單一酶種，旨在探究一種能最大程度減少乳化層厚度、提高游離油提取率且成本經(jīng)濟(jì)的水酶法提取牡丹籽油的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

去殼牡丹籽仁（產(chǎn)自山西）；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶（購于龐博生物工程有限公司）；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、高溫淀粉酶、中溫淀粉酶（購于諾維信生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

FW177中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-601電熱恒溫水浴鍋（上海偉業(yè)儀器廠）；FA2004分析天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）；數(shù)字型pH計(jì)（上海方畦儀器有限公司）；101A-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京恒星實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；凱氏定氮儀（上海安亭科學(xué)儀器廠）；JOYN-SXT-06索式提取器（上海喬越電子科技有限公司）；SX-10-12型箱式電阻爐控制箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；電子萬用爐（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽主要成分的測(cè)定

水分的測(cè)定：參照GB 5009.3—2010執(zhí)行。脂肪的測(cè)定：參照GB/T 5539—2008執(zhí)行。蛋白質(zhì)的測(cè)定：參照GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法執(zhí)行。淀粉的測(cè)定：參照GB 5009.9—2016執(zhí)行?；曳值臏y(cè)定：參照GB 5009.4—2016執(zhí)行。

1.2.2 牡丹籽油的提取工藝及操作要點(diǎn)

將未完全去殼的牡丹籽仁及雜質(zhì)剔除，剩余完全去殼牡丹籽仁用粉碎機(jī)粉碎后過篩（40目），注意粉碎時(shí)控制粉碎機(jī)溫度不宜過高，避免牡丹籽油氧化。準(zhǔn)確稱取過篩后的牡丹籽粉（50 g），與水按一定的料水質(zhì)量比混合，混合液置于恒溫水浴鍋內(nèi)，在一定的溫度、pH下攪拌一定的時(shí)間。然后，將選定的酶在其最適條件下在混合液中加入一定量的酶（酶/籽，干基計(jì)）。反應(yīng)一定的時(shí)間后，立即將混合液在3 500 r/min下離心10 min，得游離油、乳化層、水解液、渣相。取水解液，測(cè)水解液中總蛋白質(zhì)量。小心將游離油和乳化層合并后再次離心，盡可能多地從乳化層分離出游離油，稱重。將經(jīng)過兩次離心后所得乳化層采用一定的方法破乳，所得破乳油稱重。每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值。各項(xiàng)油脂提取率及水解蛋白提取率計(jì)算公式如式（1）～（4）所示：

式中：m1為游離油質(zhì)量，g；M為牡丹籽粉質(zhì)量，g；w為牡丹籽粉中脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

式中：m2為破乳所得油脂質(zhì)量，g。

式中：m3為水解液中的總蛋白質(zhì)量，g；φ為牡丹籽粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.2.3 牡丹籽預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

1.2.3.1 料水質(zhì)量比的優(yōu)化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，每份試樣分別調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8，在預(yù)處理pH 4，50℃下反應(yīng)4 h，酶解離心，計(jì)算游離油提取率，以確定最佳料水質(zhì)量比。

1.2.3.2 預(yù)處理pH的優(yōu)化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳料水質(zhì)量比混合后，每份試樣分別調(diào)節(jié)pH 2.5，3，3.5，4，5和5.5，在預(yù)處理溫度50℃下反應(yīng)4 h，酶解離心，計(jì)算游離油提取率，以確定最佳預(yù)處理pH。

1.2.3.3 預(yù)處理溫度的優(yōu)化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳料水質(zhì)量比和預(yù)處理pH處理后，每份試樣分別在溫度20，30，40，50和60℃下反應(yīng)4 h，酶解離心，計(jì)算游離油提取率，以確定最佳預(yù)處理溫度。

1.2.3.4 預(yù)處理時(shí)間的優(yōu)化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳料水質(zhì)量比、預(yù)處理pH及溫度處理后，每份試樣分別反應(yīng)5，6，7，8和9 h，酶解離心，計(jì)算游離油提取率，以確定最佳預(yù)處理時(shí)間。

1.2.3.5 預(yù)處理?xiàng)l件的正交試驗(yàn)

影響牡丹籽游離油的因素主要包括預(yù)處理料水質(zhì)量比（A）、pH（B）、溫度（C）、時(shí)間（D），每個(gè)因素根據(jù)單因素試驗(yàn)情況，選取三個(gè)顯著水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)以游離油提取率為指標(biāo)，優(yōu)化牡丹籽預(yù)處理的工藝條件。

1.2.4 牡丹籽酶解條件的優(yōu)化

1.2.4.1 酶種的選擇

參照1.2.2工藝路線，制備6份牡丹籽粉，按最佳預(yù)處理?xiàng)l件預(yù)處理牡丹籽粉后，每份試樣分別添加堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中溫淀粉酶、高溫淀粉酶，各酶制劑加酶量為2%，酶解4 h后離心，計(jì)算游離油提取率，以確定最佳酶制劑。

1.2.4.2 加酶量的優(yōu)化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳預(yù)處理?xiàng)l件及酶制劑處理后，每份試樣加酶量分別為1.5%，2%，2.5%，3%和3.5%，酶解4 h后離心，計(jì)算游離油及水解蛋白提取率，以確定最佳加酶量。

1.2.4.3 酶解時(shí)間的優(yōu)化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳預(yù)處理?xiàng)l件、酶制劑及加酶量處理后，每份試樣分別酶解3，4，5，6和7 h后離心，計(jì)算游離油及水解蛋白提取率，以確定最佳酶解時(shí)間。

1.2.5 破乳方法的優(yōu)化

參照遲延娜等[9]對(duì)花生頑固乳狀液破乳方法，并進(jìn)行有效調(diào)控。

1) 極端pH處理：將乳狀液與適量的水解液混合，調(diào)pH分別為1.5，2.5，3.5，10，11和12，室溫下攪拌1 h，以3 500 r/min離心10 min，計(jì)算破乳油提取率，取其最大值。

2) 熱處理：在100℃水浴20 min后，以3 500 r/min離心10 min，計(jì)算破乳油提取率，取其最大值。

3) 冷凍解凍處理：在-20℃冷凍12 h，90℃水浴解凍15 min后，以3 500 r/min離心10 min，計(jì)算破乳油提取率，取其最大值。

4) 乙醇輔助處理：乳狀液與50%的乙醇按1∶1的質(zhì)量比混合，室溫下攪拌30 min，以3 500 r/min離心10 min，計(jì)算破乳油提取率，取其最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫殼牡丹籽主要成分

由表1可知，牡丹籽富含油脂和蛋白質(zhì)，其中粗脂肪含量高達(dá)34.37%，蛋白質(zhì)含量接近22%，具有很高的綜合利用價(jià)值。然而，牡丹籽較高的蛋白含量也為水酶法提油帶來了困難，因?yàn)樵谒囿w系中以蛋白質(zhì)為主的表面活性劑吸附在油水界面上，極大地限制了油脂的游離，致使較多的油脂被束縛在乳化層[10]。

表1 脫殼牡丹籽主要成分 %

2.2 牡丹籽預(yù)處理?xiàng)l件的確定

油料作物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素等構(gòu)成，其中少量果膠和木質(zhì)素填充在纖維素分子形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。由表1可知，牡丹籽主要成分為油脂、蛋白質(zhì)及淀粉，而它們中的絕大多數(shù)則主要被細(xì)胞壁所包裹。Bair等[11]指出油脂體分布在由蛋白質(zhì)構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。此外，水酶法提油由于處于水環(huán)境下，蛋白質(zhì)的乳化性限制了油脂的游離，同時(shí)溶液中部分淀粉水解為糊精后也會(huì)包裹住油脂分子[12]，也限制了油脂游離。因此，在酶解之前，采用合適的方法預(yù)處理牡丹籽，使油料細(xì)胞內(nèi)油脂盡可能充分釋放，同時(shí)降低油脂被乳化的程度成為水酶法制備牡丹籽油的必要前提。

2.2.1 料水質(zhì)量比對(duì)游離油提取率的影響

料水質(zhì)量比與游離油提油率的關(guān)系見圖1。隨著料水質(zhì)量比的增加，游離油的提取率逐漸增大，當(dāng)料水質(zhì)量比大于1∶7以后，游離油的提取率呈明顯下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榱纤|(zhì)量比過小，體系黏度大，不利于油脂的游離；料液比過大，酶的相對(duì)濃度小，不利于酶解充分。雖然1∶7的游離油提取率最高，但較1∶6增幅不大，綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益，選擇料水質(zhì)量比1∶6。

圖1 料水質(zhì)量比對(duì)游離油提取率的影響

2.2.2 預(yù)處理pH對(duì)游離油提取率的影響

預(yù)處理pH與游離油提油率的關(guān)系見圖2。pH越小，游離油提取率越高，當(dāng)pH小于3.5以后，游離油提取率逐漸減少。分析原因可能是溶液pH過高，植物細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)未被充分破壞，導(dǎo)致后續(xù)酶制劑與底物接觸不充分，游離油提取率降低。隨著pH降低，植物細(xì)胞中果膠、可溶性蛋白質(zhì)及碳水化合物等物質(zhì)的溶出，使得油料細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得松散，為隨后酶制劑與底物的接觸創(chuàng)造了良好的條件[13]，利于油脂的游離。但溶液pH過低，游離脂肪酸增多，使得游離油提取率降低、油品下降。因此，選擇pH 3.5進(jìn)入下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 預(yù)處理pH對(duì)游離油提取率的影響

2.2.3 預(yù)處理溫度對(duì)游離油提取率的影響

預(yù)處理溫度與游離油提油率的關(guān)系見圖3。游離油提取率隨溫度升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。分析原因可能是隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)可溶性固形物的部分溶出，從而增強(qiáng)了后續(xù)酶與底物的接觸。但溫度過高，一方面由于牡丹籽原料淀粉含量約占到12%，淀粉發(fā)生糊化造成體系黏度增加，束縛了油脂的游離；另一方面，其會(huì)促使部分油脂水解為脂肪酸，致使游離油提取率降低。因此，溫度選取40℃進(jìn)入下一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 預(yù)處理溫度對(duì)游離油提取率的影響

2.2.4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)游離油提取率的影響

預(yù)處理時(shí)間與游離油提油率的關(guān)系見圖4。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，游離油提取率在5～7 h之間增加明顯，但超過7 h后提取率增長(zhǎng)趨勢(shì)不顯著。考慮的生產(chǎn)成本，選取7 h進(jìn)入下一步工藝優(yōu)化。

圖4 預(yù)處理時(shí)間對(duì)游離油提取率的影響

2.2.5 牡丹籽預(yù)處理?xiàng)l件的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)因素水平見表2，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。極差分析結(jié)果表明，影響牡丹籽游離油提取率因素的順序?yàn)轭A(yù)處理pH＞溫度＞時(shí)間＞料水質(zhì)量比；水酶法提取牡丹籽油預(yù)處理的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即預(yù)處理料水質(zhì)量比為1∶6、pH為3.5、溫度40℃、時(shí)間8 h。在此條件下，游離油提取率為69.65%。

2.3 牡丹籽酶解條件的確定

2.3.1 酶種對(duì)游離油提取率的影響

對(duì)各酶制劑進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，所得最適溫度和pH見表4。不同酶種與游離油提油率的關(guān)系見圖5。選用四種蛋白酶時(shí)游離油提取率均比兩種淀粉酶高，分析原因可能是在水相體系中，牡丹籽較高的蛋白含量及溶液攪拌過程中形成的脂蛋白復(fù)合體，對(duì)油脂的游離起主要限制作用。其中選用堿性蛋白酶時(shí)游離油提取率最高，因此選取堿性蛋白酶為最佳酶種。

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 不同蛋白酶最適溫度和pH

圖5 不同酶種對(duì)游離油提取率的影響

2.3.2 加酶量對(duì)游離油及水解蛋白提取率的影響

加酶量與游離油及水解蛋白提取率的關(guān)系見圖6，隨著加酶量的增加，游離油和水解蛋白提取率不斷增加，但當(dāng)超過3%以后，游離油與水解蛋白提取率趨于穩(wěn)定。這一點(diǎn)與Rhee等[14]所發(fā)現(xiàn)是是一致的，即油脂的提取率與水解蛋白質(zhì)的提取率有很好的正相關(guān)性。分析原因可能式加酶量太少，蛋白質(zhì)未被充分酶解，仍有較多蛋白質(zhì)與油脂構(gòu)成的復(fù)合體，隨著加酶量增多，脂蛋白復(fù)合體不斷被分解，大部分油脂基本被萃取出來，繼續(xù)增加酶量對(duì)游離油提取率沒有多大改變[15]，最終選定加酶量為3%進(jìn)入下一優(yōu)化試驗(yàn)。

圖6 不同加酶量對(duì)游離油及水解蛋白提取率的影響

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)游離油及水解蛋白提取率的影響

酶解時(shí)間與游離油及水解蛋白提取率的關(guān)系見圖7。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，游離油及水解蛋白提取率逐漸增加，但當(dāng)超過5 h后提取率增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。分析原因可能式隨著酶解時(shí)間的增加，脂蛋白復(fù)合體被充分地分解，油脂釋放增加。但是，當(dāng)酶解反應(yīng)進(jìn)行了一段時(shí)間后，底物的減少導(dǎo)致油脂的釋放不會(huì)繼續(xù)增加，并且較長(zhǎng)時(shí)間的酶解對(duì)油脂的品質(zhì)有不利的影響[16]。因此，最終選定酶解時(shí)間為5 h，此時(shí)牡丹籽游離油提取率為86.21%，且酶解離心后的乳化層較少。

圖7 不同酶解時(shí)間對(duì)游離油及水解蛋白提取率的影響

2.4 破乳方法對(duì)破乳油提取率的影響

考慮到50 g原料在最佳提取工藝下乳化層較少，因此取250 g進(jìn)行試驗(yàn)。不同破乳方法與破乳油提取率的關(guān)系見圖8。

圖8 不同破乳方法對(duì)破乳油提取率的影響

乳化層經(jīng)冷凍解凍處理后，破乳油提取率最高，達(dá)到5.78%，此時(shí)牡丹籽總清油提取率多達(dá)91.23%。分析原因可能是冷凍過程中乳狀液中的油滴結(jié)晶，可以刺入水相，以及相鄰油滴間的界面膜，從而引起油滴聚集[17]。由圖8可知，乙醇輔助處理也顯示出較好的效果，但會(huì)引入有機(jī)溶劑，致使成品油中會(huì)有微量溶劑殘留，不利于人體健康。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用酸熱法預(yù)處理結(jié)合堿性蛋白酶酶解提取牡丹籽油，得到最佳提油工藝：牡丹籽粉按料水質(zhì)量比1∶6、pH 3.5、溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間8 h。在堿性蛋白酶最適條件下，加入3%的酶量，反應(yīng)5 h，此時(shí)牡丹籽游離油提取率多達(dá)86.21%，且乳化層較少。在最佳提取工藝條件下，稱取250 g牡丹籽粉進(jìn)行破乳研究，得到的最佳破乳條件為冷凍解凍處理，即-20℃冷凍12 h、90℃水浴15 min、以3 500 r/min離心10 min。結(jié)果表明，破乳油提取率可達(dá)5.78%，此時(shí)牡丹籽總清油提取率可達(dá)91.23%。與多酶法提取相比，采用該工藝所得乳化層較少，游離油提取率顯著提升，且整個(gè)工藝過程沒有較高溫度，僅使用單一酶，因而有助于降低成本。