姜艷紅， 焦揚(yáng)， 陳光意， 盛家和， 許青霞

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科(河南鄭州 450008)

急性髓細(xì)胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由于造血干細(xì)胞發(fā)生了染色體畸變、融合基因形成和(或)同時(shí)存在體細(xì)胞突變等異常事件，導(dǎo)致正常造血干細(xì)胞的增殖失控、分化受阻及調(diào)控異常，從而促使其惡性轉(zhuǎn)化并且無限增殖的一類高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)疾病。Auer小體是1906年由美國醫(yī)師John Auer發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)比較常見的，是由嗜苯胺藍(lán)顆粒融合而成的桿狀物資，此外，也會(huì)有其他的形狀存在，如顆粒狀等等，顏色可以為紫紅色。在AML中有高度特異度[1]，以往文獻(xiàn)對(duì)有無Auer小體的AML患者實(shí)驗(yàn)室、臨床以及預(yù)后特點(diǎn)的總結(jié)不完全一致，現(xiàn)收集我院近年來初治原發(fā)AML(非AML-M3)患者，對(duì)比分析Auer小體陽性與陰性AML患者的實(shí)驗(yàn)室、臨床和預(yù)后特點(diǎn)，希望所得結(jié)果能對(duì)AML患者的診治有所幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2017年12月河南省腫瘤醫(yī)院血液科所有初治原發(fā)AML住院患者325例，所有患者經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)分析，AML診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)參照WHO[2]和張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]，除去AML-M3患者，符合要求患者248例，包括男145例，女103例，年齡1～80歲。本研究均獲得患者知情同意，并經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 患者臨床資料 通過查閱病歷獲得。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 抽取外周血和骨髓液制涂片，快速干燥后進(jìn)行瑞氏染色，根據(jù)需要進(jìn)行特殊細(xì)胞化學(xué)染色，包括過氧化物酶、堿性磷酸酶、特異度酯酶、非特異度酯酶及糖原染色等，進(jìn)行形態(tài)學(xué)分型。

1.2.3 免疫學(xué)分型檢查 抽取骨髓液2 mL并用肝素抗凝，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記的單克隆抗體檢測(cè)白血病細(xì)胞的表面抗原，并通過計(jì)算幼稚細(xì)胞抗原的表達(dá)比例來確定陽性細(xì)胞數(shù)；以細(xì)胞胞膜抗原表達(dá)比例≥20%，胞漿抗原表達(dá)比例≥10%為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算抗原的陽性率。

1.2.4 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 通過骨髓細(xì)胞直接法和(或)24 h培養(yǎng)法，按照常規(guī)制備染色體，正常核型至少要分析20個(gè)分裂象，異常核型至少要分析10個(gè)分裂象。核型異常描述依據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN 2013)》的規(guī)定進(jìn)行[4]。

1.2.5 分子生物學(xué)檢查 通過熒光定量PCR檢測(cè)AML相關(guān)融合基因，采用二代測(cè)序方法檢測(cè)WT1、c-KIT、FLT3-ITD、FLT3-TKD等AML相關(guān)基因突變。

1.2.6 治療 AML患者分別接受HAA(高三尖杉酯堿、阿克拉霉素、阿糖胞苷)、DA(去甲氧柔紅霉素、阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)等標(biāo)準(zhǔn)方案化療，部分患者緩解后接受自體或異基因造血干細(xì)胞移植。

1.2.7 療效評(píng)價(jià) 誘導(dǎo)化療后3～4周進(jìn)行骨髓檢查評(píng)價(jià)療效，完全緩解(CR)患者給予鞏固化療，部分緩解(PR)和原始細(xì)胞下降>50%者給予第2次誘導(dǎo)化療，2個(gè)療程后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。

1.2.8 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 完全緩解(CR)、形態(tài)學(xué)完全緩解而血細(xì)胞計(jì)數(shù)未完全恢復(fù)(CRi)、部分緩解(PR)、治療失敗。

1.2.9 隨訪 所有入選患者隨訪至2018年12月31日，總生存期(OS)通過查閱病歷或打電話獲取。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床特點(diǎn)分析 本研究入組248例患者，根據(jù)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果有Auer小體，分為Auer小體陽性組(ARPG)和Auer小體陰性組(ARNG)，從性別、年齡、既往病史、發(fā)熱、出血情況、肢體疼痛、貧血癥狀、心血管疾病癥狀、呼吸系統(tǒng)疾病癥狀、消化系統(tǒng)疾病癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀對(duì)兩組患者進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩組間心血管疾病癥狀和消化系統(tǒng)疾病癥狀的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余臨床特點(diǎn)在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 一般臨床特點(diǎn) 例(%)

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果特點(diǎn)分析 本研究從AML患者血常規(guī)、骨髓細(xì)胞形態(tài)、染色體核型預(yù)后、常見AML融合基因、常見AML基因突變和FAB分型對(duì)ARPG和ARNG進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)染色體預(yù)后良好和預(yù)后中等核型、融合基因AML-ETO、突變基因NPM1和c-KIT、FAB分型中的M2和M5在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 誘導(dǎo)緩解治療情況對(duì)比分析 本研究248例患者中有5例放棄治療，最終ARPG 143例和ARNG 100例進(jìn)行了治療，分別從CR、CRi、PR和治療失敗進(jìn)行誘導(dǎo)緩解治療結(jié)果對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)CR和治療失敗在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CRi和PR在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.4 生存分析 對(duì)接受治療的243例患者進(jìn)行隨訪，通過Kaplan-Meier生存分析，ARPG患者中位OS為15個(gè)月，ARNG患者中位OS為11個(gè)月，通過Log-rank test對(duì)生存曲線進(jìn)行對(duì)比分析，兩組OS間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=3.335，P>0.05)，見圖1。

3 討論

Auer小體是細(xì)胞漿的中一和種針狀內(nèi)容物，可見AML患者原始和較成熟的細(xì)胞，它是AML的一種特殊的病理特征，可見于30%～54%的AML患者[5]。電鏡顯示[6]Auer小體與細(xì)胞內(nèi)的嗜天青顆粒結(jié)構(gòu)電子密度相似，呈層紋狀結(jié)構(gòu)，有規(guī)律排列；過氧化物酶染色、蘇丹黑染色、糖原染色、酸性磷酸酶染色和堿性磷酸酶染色均為陽性，而脂肪酶和核酸染色為陰性，因此，推測(cè)Auer小體是由胞漿內(nèi)嗜天青顆粒融合而成[7]。Jain等[8]認(rèn)為白血病患者骨髓或外周血涂片中見到Auer小體不但有診斷意義，而且可以排除急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷，他們的研究結(jié)果顯示AML患者中占66.3%。本研究中248例入選AML患者中有145例(58.5%)是細(xì)胞漿中Auer小體是陽性的，與既往文獻(xiàn)接近，畢竟觀察Auer小體主觀因素很大，再一就是骨髓涂片制作水平也是影響對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物觀察的主要因素，涂片均勻，細(xì)胞展開的完全才能更好地觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最后顯微鏡的亮度對(duì)細(xì)胞形態(tài)的分析也是重要因素，光線太暗，Auer小體容易被其他細(xì)胞內(nèi)容物掩蓋，光線太強(qiáng)，會(huì)把細(xì)胞打透，也觀察不到Auer小體。

Billstr?m等[5]認(rèn)為Auer小體陽性AML患者所占比例與患者年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Hassan等[9]的研究顯示Auer小體陽性AML患者的年齡較小且細(xì)胞分化較好。本研究以60歲為界限把入組AML患者分為兩組，雖然ARPG患者<60歲患者所占比例(82.76%)>ARNG患者(77.67%)，而60歲以上患者(17.24%)小于ARNG患者(22.34%)，但兩組患者的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.318)。眾所周知，白血病常見臨床癥狀出血、貧血和感染，自然是患者體內(nèi)PLT、HGB/RBC和WBC質(zhì)和量的變化引起的，本研究中ARPG和ARNG患者PLT、HGB/RBC和WBC間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與兩組間出血、貧血和感染癥狀無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異是一致的。AML患者常會(huì)伴有骨骼的疼痛，這是白血病細(xì)胞大量增殖引起骨髓腔內(nèi)壓力增高而導(dǎo)致的，骨髓的增生程度越高、白血病細(xì)胞所占比例越高，患者肢體疼痛就越明顯，本研究兩組患者間肢體疼痛和骨髓原始細(xì)胞比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在一般臨床特點(diǎn)的分析中，本文還分析了兩組間性別、既往病史、心血管疾病癥狀、呼吸系統(tǒng)疾病癥狀、消化系統(tǒng)疾病癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀的不同，但除了ARPG患者有心血管疾病癥狀比例低于ARNG患者(P=0.004)而有消化系統(tǒng)疾病癥狀比例高于ARNG患者(P=0.004)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余特點(diǎn)在兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些差異是否與Auer小體的存在有相關(guān)性，還需進(jìn)一步證實(shí)。

實(shí)驗(yàn)室檢查ARPGARNGZ/2值P值骨髓原始細(xì)胞比例(%)0.55±0.220.57±0.25-0.4170.638外周血細(xì)胞 WBC?12.59(4.58,32.88)13.41(2.9,52.94)7 407.5000.914 RBC?2.4(1.99,2.92)2.36(1.91,2.88)6 951.0000.353 HGB80.81±22.0777.51±21.151.1780.240 PLT?39(22,59)42(20,76)7 206.5000.639染色體核型預(yù)后(例) 預(yù)后良好32318.2320.000# 預(yù)后中等104875.5240.019# 預(yù)后不良9133.0650.080#融合基因(例) AML-ETO39618.0020.000#AML相關(guān)突變(例) FLT3-ITD24160.0460.830# FLT3-TKD850.0530.817# NPM115161.4830.023# TET21031.9240.165# CEBPA913.0210.082△ DNMT3A760.1210.728# c-KIT1216.4700.011# EP300740.0020.966△ WT146330.0030.958# IKZF11251.1040.293#FAB分型(例) M2973520.2080.000# M41360.5370.464# M5315222.9120.000#

注：*：采用M(P25,P75)表示；#表示通過普通的2檢驗(yàn)；△表示通過連續(xù)校正的2檢驗(yàn)

表3 誘導(dǎo)緩解治療情況

圖1 ARPG和ARNG患者生存曲線Log-rank分析

Auer小體是AML的獨(dú)立診斷標(biāo)準(zhǔn)，亦有報(bào)道出現(xiàn)于急性混合性白血病[10]；Jain等[8]的研究認(rèn)為Auer小體陽性AML患者多為FAB分型中的M2和M4，少數(shù)為M1和M3，極少數(shù)為M5；Hassan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)Auer小體在M2與M3中的檢出率最高，其次為M4與M5，Auer小體的出現(xiàn)是預(yù)后較好的重要標(biāo)志；我國學(xué)者白清宇等[11]認(rèn)為Auer小體的出現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上標(biāo)志該細(xì)胞起源于白血病克隆，在非M3的AML尤其多見于粒系白血病中的M2型，少見于急性單核細(xì)胞白血病。從以上文獻(xiàn)可見Auer小體易見于M2，而少見于M5，其他急性髓系白血病亞型則報(bào)道不一致。本研究AML患者ARPG中有97例(66.90%)為M2型，明顯高于APNG中35例(33.98%)為M2型，而ARPG中有31例(21.38%)為M5型，明顯低于APNG中52例(50.48%)為M5型，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但ARPG與ARNG組患者M(jìn)4所占比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究所有患者均通過熒光定量PCR檢測(cè)AML1-ETO、PML-RARα、CBFβ/MYH11等13種AML相關(guān)融合基因，但除AML1-ETO在兩組患者中均有較多表達(dá)外，其他融合基因表達(dá)較少，如果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的話意義較小，所以本研究僅對(duì)AML1-ETO在兩組患者中進(jìn)行了對(duì)比分析，ARPG患者AML1-ETO陽性比例26.9%(39/145)明顯高于ARNG患者5.83%(6/103)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣本研究通過采用二代測(cè)序方法檢測(cè)NPM1、FLT3-ITD、FLT3-TKD等53種AML相關(guān)基因突變，剔除在兩組患者中突變較少的位點(diǎn)，最終本研究對(duì)FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1、TET2、CEBPA、DNMT3A、c-KIT、EP300、WT1和IKZF1在兩組患者中發(fā)生突變的差異，結(jié)果ARPG患者NPM1發(fā)生突變比例10.34%(15/145)，低于ARNG患者15.53%(16/103)，而c-KIT突變比例8.28%(12/145)高于ARNG患者0.1%(1/103)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2001年世界衛(wèi)生組織提出的造血和淋巴系統(tǒng)疾病分型標(biāo)準(zhǔn)中，將伴有AMLl-ETO融合基因的AML定義為一種獨(dú)立亞型，并認(rèn)為AMLl-ETO陽性AML往往預(yù)后良好，研究表明，AMLl-ETO陽性AML患者的化療緩解率較高[12]。本研究患者除去ARPG 2例和APNG 3例患者放棄治療，其余243例均接受正規(guī)化療，誘導(dǎo)化療后，ARPG患者63.64%(91/143)獲得CR，高于ARNG患者48%(48/100)，而治療失敗獲得CR患者9.79%(14/143)，低于ARNG患者23%(23/100)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與胡忠利等[13]對(duì)21例Auer陽性患者和71例Auer陰性患者的初次誘導(dǎo)緩解率發(fā)現(xiàn)，Auer小體陽性的AML初次誘導(dǎo)緩解率明顯較高的研究結(jié)果一致。結(jié)合本研究兩組AMLl-ETO陽性的差異，與上述文獻(xiàn)一致。但兩組間獲得CRi和PR患者比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與Billstr?m等[5]研究結(jié)論Auer小體陽性AML患者多為預(yù)后良好和中等核型，而Auer小體陰性患者多為預(yù)后不良核型，不完全一致，本研究發(fā)現(xiàn)ARPG患者預(yù)后良好核型比例22.07%(32/145)，高于ARNG患者2.91%(3/103)，而預(yù)后中等核型比例71.72%(104/145)，低于ARNG患者84.47%(87/103)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組間預(yù)后不良核型患者比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。目前細(xì)胞遺傳學(xué)異常仍是AML進(jìn)行疾病診斷、預(yù)后評(píng)分層和治療方案制定中重要的指標(biāo)之一，是世界衛(wèi)生組織和美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)對(duì)AML分類和預(yù)后分層的主要依據(jù)，但科學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)，即使具有相同的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，AML的治療效果及長期預(yù)后也大不一樣，如伴有t(8；21)(q22；q22)遺傳學(xué)異常的AML曾被認(rèn)為是一種預(yù)后良好的亞型，而隨著分子生物學(xué)研究的深入，尤其是c-KIT基因突變的發(fā)現(xiàn)使得這部分AML的預(yù)后被重新劃分，即伴有c-KIT基因突變的t(8；21)AML患者疾病復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[14]。正常由于這個(gè)原因，盡管Arber等[15]認(rèn)為NPM1突變提示相對(duì)較好的預(yù)后，c-KIT突變的患者預(yù)示著更差的預(yù)后，再加上新的化療及靶向的藥物的不斷出現(xiàn)和化療方案的持續(xù)改進(jìn)，導(dǎo)致現(xiàn)在Auer小體陽性與陰性患者的預(yù)后與20世紀(jì)Hassan等[9]的研究結(jié)果Auer小體陽性AML患者有較好的預(yù)后，及Billstr?m等[5]的研究結(jié)果Auer小體陽性AML患者OS要長于Auer小體陰性者不同，本研究結(jié)果顯示盡管ARPG的OS高于ARNG患者，但兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而與近年來胡忠利等[13]隨訪了8例Auer陽性與20例Auer陰性患者，發(fā)現(xiàn)兩者的OS沒有明顯差異的結(jié)論一致。

綜上所述，與Auer小體陰性患者相比，Auer小體陽性患者多為FAB分型中AML1-ETO融合基因陽性的AML-M2，少見于AML-M5，常伴有消化系統(tǒng)疾病癥狀，而少有心血管系統(tǒng)疾病癥狀，預(yù)后良好核型比例較高，但預(yù)后中等核型偏低，易伴c-KIT基因突變，而NPM1突變少見，有較高的CR率，但兩者的OS差異不明顯。