林輝 周懿 周燚 李慧芬 楊遠 侯克柱△

(1.上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院普外一科，上海 200438； 2.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院肝外三科，上海 200433)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)被認(rèn)為是最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。盡管臨床上肝癌治療取得了一定的進展，但肝癌患者5年生存率仍低于30%[3]。因此，迫切需要闡明肝癌發(fā)生和進展的潛在分子機制，為肝癌的治療提供有效的治療策略。MiRNA(miR)長度一般為18～25個核苷酸，通過與靶基因的3’-未翻譯區(qū)域結(jié)合，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，具有癌基因和抑癌基因的作用，直接或間接參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。其中，miR-301b-3p被證實介導(dǎo)了多種腫瘤增殖，但miR-301b-3p在肝細(xì)胞癌中的作用尚未見報道。本研究通過體內(nèi)和體外實驗，旨在探索miR-301b-3p過表達對肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為的影響。

1 資料和方法

1.1研究對象 選取2012年12月至2014年12月在第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院進行根治手術(shù)的肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織，共計61例。患者在手術(shù)前均未接受過藥物及放療化療處理。手術(shù)標(biāo)本切下后，迅速將組織分離，無菌生理鹽水沖洗2遍后，用4%多聚甲醛固定，另外取部分組織標(biāo)本裝于凍存管中置于液氮中速凍，置入-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩１緦嶒炛袠?biāo)本的病理診斷由我院擁有5年以上經(jīng)驗的病理醫(yī)師檢查每個組織樣本確認(rèn)組織類型。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有樣本采集均獲得患者本人及其家屬的同意并均簽署了知情同意書。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染正常肝細(xì)胞系HL7702、人肝癌細(xì)胞株(HepG2﹑Hep3B﹑和 Huh7)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。細(xì)胞株使用DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞倍增時間決定傳代時間，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶底的80%時，用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)進行消化傳代。miR-301b-3p mimics和相應(yīng)的對照組均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。SATB2基因過表達慢病毒和對照物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。具體轉(zhuǎn)染步驟依照參考文獻進行[6]。

1.2.2qRT-PCR檢測 采用Trizol提取組織和細(xì)胞總RNA，后續(xù)實驗依照參考文獻進行[6]。以U6為miR-497-5p的內(nèi)參基因;β-actin為SATB2的內(nèi)參基因。使用 2-ΔΔCt方法計算miR-497-5p和SATB2的相對表達水平。引物序列如下：

SATB2：上游5’-CCTGGCCCTGGGGTATTCT-3’下游5’-GTGCATCTGTCACATAACTGAGG-3’GAPDH：上游 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’下游 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

1.2.3CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 將經(jīng)過轉(zhuǎn)染處理的各組HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12，24，36 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液(上海東仁化學(xué)科技公司)，注意避免產(chǎn)生氣泡，后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度，重復(fù)3次。分析兩組細(xì)胞的活力。

1.2.4雙熒光素酶報告實驗 用胰蛋白酶消化HepG2細(xì)胞，離心后重懸于含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中并按1×104個細(xì)胞/孔的密度接種于48孔板上，培養(yǎng)24 h后(此時細(xì)胞密度為約50%)，后續(xù)實驗依照參考文獻進行[6]。轉(zhuǎn)染48 h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay裂解細(xì)胞并用多功能酶標(biāo)儀測定熒光素酶活性。

1.2.5蛋白免疫印跡 具體實驗步驟依照參考文獻進行[6]。即，取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心收集沉淀，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，一抗二抗溫育后，采用ECL顯影液曝光。一抗(濃度1∶500)，二抗(濃度1∶2 000)，本研究所用抗體SATB2和GAPDH均為兔抗人多抗，購自英國Abcam公司。

2 結(jié) 果

2.1miR-301b-3p在HCC組織和細(xì)胞系中的下調(diào)表達 為了確定miR-301b-3p在HCC中的表達情況，采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-301b-3p在HCC組織及對應(yīng)癌旁組織、肝癌細(xì)胞、和肝細(xì)胞中的表達水平。如圖1A所示，與對應(yīng)的癌旁組織(0.515±0.036)相比，miR-301b-3p在HCC組織(0.286±0.022)中表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。此外，我們還檢測了miR-301b-3p在HCC細(xì)胞系(HepG2、Hep3B、Huh7)和肝細(xì)胞(HL7702)中的表達水平。結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞HL7702(1.000±0.092)相比，miR-301b-3p在各HCC細(xì)胞HepG2(0.271±0.027)、Hep3B(0.231±0.166)、和Huh7(0.282±0.147)中表達下調(diào)表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1B)。以上數(shù)據(jù)提示miR-301b-3p在HCC中能下調(diào)表達。

注：A.miR-301b-3p在肝癌組織及癌旁組織中的表達；B.miR-301b-3p在肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7和HL7702中的表達水平。*P<0.05；*P<0.001；*P<0.001。圖1 miR-301b-3p在HCC組織和細(xì)胞系中的下調(diào)表達

2.2過表達miR-301b-3p抑制HCC細(xì)胞增殖 為了研究miR-301b-3p在HCC的生物學(xué)功能，將miR-301b-3p mimic轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組(1.000±0.110)相比，miR-301b-3p在miR-301b-3p mimic組(4.015±0.464)表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，證實HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高(圖2A)。此外，我們還檢測了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖情況。如圖2B所示，與對照組相比，miR-301b-3p mimic組細(xì)胞的增殖能力在24 h后顯著被抑制，差距有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 以上數(shù)據(jù)表明，過表達miR-301b-3p過有效抑制HePG2細(xì)胞的增殖能力。

注：A.模擬mir-301b-3p 轉(zhuǎn)染后，應(yīng)用 qrt-pcr 定量檢測 mir-301b-3p 的表達水平；B. 模擬 mir-301b-3p 轉(zhuǎn)染 hepg2細(xì)胞12、24、36 h后，用 cck-8法測定細(xì)胞增殖率。*P<0.05；*P<0.001；*P<0.001。圖2 miR-301b-3p過度表達對細(xì)胞增殖的影響

2.3SATB2是miR-301b-3p在HCC細(xì)胞中的直接作用靶點 通過生物信息學(xué)分析，提示SATB23’-UTR含有miR-301b-3p的潛在結(jié)合靶點(圖3A)。為了驗證miR-301b-3p與SATB2之間的關(guān)系，將miR-301b-3p mimic轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，隨后通過熒光素酶活性、qRT-PCR和Western Blot驗證miR-301b-3p與SATB2的作用關(guān)系。如圖3B所示，雙熒光素酶報告試驗證實在HepG2中，miR-301b-3p mimic組細(xì)胞的SATB2 wt 3’UTR熒光素酶活性(0.460±0.089)比對照組細(xì)胞的SATB2 wt 3’UTR熒光素酶活性(1.000 ±0.098)降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015)；miR-301b-3p mimic組細(xì)胞的SATB2 mut 3’UTR熒光素酶活性(0.967±0.083)與對照組細(xì)胞的SATB2 mut 3’UTR熒光素酶活性(1.013±0.021)相比無差別(P>0.05)。如圖3C結(jié)果提示miR-301b-3p mimic組細(xì)胞的SATB2的mRNA水平(0.299±0.035)顯著比對照組細(xì)胞的SATB2的mRNA水平(1.000±0.098)降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。蛋白免疫印跡結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染miR-301b-3p mimic可顯著降低HepG2中SATB2蛋白的表達(圖3D)。以上數(shù)據(jù)表明，miR-301b-3p靶向SATB2 3’-UTR并抑制其在HCC細(xì)胞中的表達。

注：A.在STAB2的3’UTR中預(yù)測miR-301b-3p靶位點；B.STAB2 wt的相對熒光素酶活性，轉(zhuǎn)染miR-301b-3p模擬物后，用雙熒光素酶報告試劑盒測定STAB2 mut；C.用qRT-PCR檢測SATB2 mRNA的表達；D.用Western Blot檢測SATB2蛋白的表達。*P<0.05、*P<0.01；*P<0.001。圖3 miR-301b-3p靶向肝癌細(xì)胞中的SATB2

2.4過表達SATB2可抵消miR-301b-3p對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用 為了確定SATB2是否參與miR-301b-3p調(diào)控的細(xì)胞增殖，首先將過表達miR-301b-3p慢病毒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞系中過表達SATB2蛋白。轉(zhuǎn)染后，Western blot檢測IGF-1R蛋白水平驗證轉(zhuǎn)染效率。如圖4A所示，miR-301b-3p+SATB2組的SATB2蛋白表達明顯高于miR-301b-3p組。然后進行CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況。研究數(shù)據(jù)顯示，miR-301b-3p+SATB2組HepG2細(xì)胞的增殖能力明顯高于miR-301b-3p組(圖4B)。以上數(shù)據(jù)說明，過表達SATB2蛋白抵消了miR-301b-3p對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

注：A.Western Blot檢測轉(zhuǎn)染過表達SATB2后HepG2細(xì)胞中SATB2蛋白的表達；B.轉(zhuǎn)染miR-301b-3p模擬和過表達SATB2后12、24、36 h，用CCK-8法檢測HepG2細(xì)胞增殖率。*P<0.05、*P<0.01；*P<0.001。圖4 miR-301b-3p通過抑制SATB2調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖

3 討 論

越來越多的研究證實異常表達的miRNA在多種癌癥中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，miRNA通過負(fù)調(diào)控基因的表達，在腫瘤的進展中扮演雙重角色，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[7]。本研究顯示miR-301b-3p在HCC 細(xì)胞系和組織中下調(diào)表達。為了闡明miR-301b-3p在HCC中的生物學(xué)作用，將miR-301b-3p mimic轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞。細(xì)胞功能學(xué)實驗證實，過表達miR-301b-3p可明顯抑制hepg2細(xì)胞的增殖能力。這些結(jié)果表明miR-301b-3p可能作為一種抑癌基因，其肝癌的進展中發(fā)揮抑制作用。

眾所周知，miRNA通過與下游靶基因結(jié)合發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。SATB2是核基質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重構(gòu)[8-9]。大量研究證實SATB2在多種惡性腫瘤中異常表達[10-11]。研究報道證實[12]，SATB2在HCC中上調(diào)表達，過表達SATB2可以促進HCC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。另有報道[13]證實MiR-34a通過下調(diào)SATB2抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖、遷移和侵襲。然而，miR-301b-3p與SATB2在HCC中的關(guān)系尚不清楚。通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)SATB2的3’-UTR中含有一個miR-301b-3p結(jié)合的靶點。通過熒光素酶報告試驗進一步證實了生物信息學(xué)的預(yù)測的準(zhǔn)確性。此外，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-301b-3p mimic后，HepG2細(xì)胞中SATB2的mRNA和蛋白水平均下降，說明SATB2是miR-301b-3p的下游靶基因，且miR-301b-3p不僅可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控SATB2的表達，而且也可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控SATB2的表達。為進一步確定miR-301b-3p是否通過調(diào)控SATB2表達介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖，將HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染SATB2過表達慢病毒。在研究中發(fā)現(xiàn)，過表達SATB2可以抵消miR-301b-3p mimic對HepG2細(xì)胞增殖的抑制影響，表明miR-301b-3p通過抑制SATB2來調(diào)控HCC細(xì)胞的增殖能力。

綜上所述，本研究表明miR-301b-3p通過抑制細(xì)胞增殖在HCC中發(fā)揮抑癌作用。此外，我們首先發(fā)現(xiàn)miR-301b-3p通過抑制SATB2抑制HCC進展。這些發(fā)現(xiàn)是令人鼓舞的，并提示miR-301b-3p可能作為一種新的和有效的HCCin治療靶點。但miR-301b-3p調(diào)控HCC進展的機制仍有待進一步研究。