彭延波，葉昌邦，陶燦，鄧淑君，林潔柔，許匯成，盧煥俊，劉冰，趙平

(廣東藥科大學1.醫(yī)藥化工學院，廣東 中山528458； 2.藥學院，廣東 廣州 510006)

目前，化療仍然是癌癥治療最重要的手段，然而化療藥物的全身毒性、耐藥性和低選擇性等缺點導致治療效果并不理想[1-2]。近年來，關于制定新的治療方案來提高化療治愈率和降低毒副作用的研究受到了廣泛關注[3-5]，磁性納米粒子是其中一種引起科研人員濃厚興趣的方案，可用于多功能磁共振成像(MRI)、靶向藥物遞送、磁熱療等領域[6]，特別是超順磁性納米粒子可以用于構建核殼結構的核心，充分發(fā)揮包括藥物遞送、靶向治療和成像等在內的多種功能，是目前的研究熱點[7-8]。

在化療藥物中，以阿霉素、道諾霉素為代表的蒽環(huán)類藥物被證實對80%的實體腫瘤具有殺傷效果[9]。然而，隨著用藥劑量的增加，藥物在正常細胞中殘留而導致的不良反應也愈加突出。因此，臨床迫切希望能尋求安全有效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物運載方式[10-11]。

在前期研究的基礎上，本文以超順磁性Fe3O4納米粒子為磁核、ZrO2為殼層制備納米復合體系用于固載蒽環(huán)類抗腫瘤藥物道諾霉素，考察該載藥體系對諾霉素的運載情況，并對其抗肺癌活性進行了評價，以期為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的運輸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

FeCl3、FeCl2(分析純，廣州化學試劑廠)；二甲基亞砜(DMSO)、NH4Cl(分析純，上海試劑一廠)；谷胱甘肽(GSH)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)均為分析純，由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；丁二酸酐(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；正丁醇鋯(80%)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，99%)、嗎啉乙磺酸(MES，99%)均由麥克林公司提供；道諾霉素(DNM，分析純，Sigma公司)；噻唑蘭(MTT，碧云天生物科技公司)。

人肺癌細胞A549由中山大學附屬第一醫(yī)院獲得。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米顆粒Fe3O4的制備

取2.0 g FeCl3和0.95 g FeCl2溶解于100 mL去氧離子水中，通入氮氣，在機械攪拌器的攪拌下，將反應體系升溫至80 ℃回流并恒溫攪拌10 min后，迅速加入25%(體積分數(shù)，下同)氨水，將pH調節(jié)至10～11，高速攪拌40 min后，停止反應，磁場分離，用去離子水洗滌至中性，即得磁性納米Fe3O4顆粒。

1.2.2 磁性介孔二氧化鋯(MZr)的合成

取100 mg Fe3O4磁性納米顆粒分散于裝有100 mL乙醇和100 mL去離子水混合溶液的三口燒瓶中，快速加入25%氨水2 mL，在室溫下攪拌10 min，逐滴加入5 mL溶有100 μL正丁醇鋯的乙醇溶液，室溫下機械攪拌24 h，加入70 mL溶有350 mg CTAB的乙醇溶液，繼續(xù)攪拌24 h。

反應結束后，磁場分離出黑色的磁性納米粒子，用溶有600 mg NH4Cl的100 mL乙醇和30 mL去離子水溶液轉移到250 mL的三口燒瓶內，在80 ℃下攪拌回流1 h，回流2次以徹底去除CTAB?；亓鹘Y束后，分離出磁流體，并用乙醇和去離子水反復洗滌，即得磁性介孔二氧化鋯(MZr)。

1.2.3 羧基修飾磁性二氧化鋯微球(CMZr)的合成

取80 mg磁性介孔二氧化鋯(MZr)納米粒子分散于150 mL乙醇中，室溫攪拌10 min之后加入1 mL APTES，繼續(xù)攪拌4 h，逐滴滴加預先備好的丁二酸酐溶液(0.25 g丁二酸酐溶于5 mL DMF中)，然后繼續(xù)攪拌反應24 h。反應結束后，去離子水洗滌，磁性分離，即得羧基修飾磁性二氧化鋯微球(CMZr)。

1.2.4 磁性介孔氧化鋯載藥微球(DNM@MMZr)的制備

取10 mg CMZr微球于試管中，加入0.6 mmol/L DNM溶液5 mL，放置于恒溫搖床中避光振搖24 h，即可得到藥物固載后的載藥體系。取100 mg載藥體系分散于50 mL去離子水中，室溫下機械攪拌，用MES調節(jié)pH值至4～5，滴加0.1 mmol/L KMnO4溶液5 mL，滴加完畢后升溫到80 ℃，高速攪拌40 min后，停止反應，磁場分離，用去離子水洗滌至中性，即得MnO2封堵后的磁性載藥微球(DNM@MMZr)。

類似方法，以空白CMZr直接用MnO2封堵，得到封堵后的空白載體MMZr。

1.2.5 DNM@MMZr微球的GSH專一性試驗

配制濃度為8 mmol/L的KCl、NaCl、Na2SO4、Glucose、GSH及空白PBS溶液，分別加入10 mg DNM@MMZr微球，在恒溫搖床中振搖1 h后，取樣、用紫外可見分光光度計測試微球在不同溶質中475 nm處的吸光度[8]，計算DNM的緩釋率。

1.2.6 MMZr載體生物相容性研究

A549細胞接種于96孔板(7×103個/孔)中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的MMZr載體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，除去MTT，加入150 μL DMSO，在避光下置恒溫搖床中振搖5 min，用酶標儀在490 nm波長下進行測定[10]，檢測載體對細胞的損傷情況。

1.2.7 DNM@MMZr微球的磁靶向實驗

A549細胞在60 mm的培養(yǎng)皿中接種培養(yǎng)24 h，加入100 μg/mL DNM@MMZr微球，將磁鐵放置于培養(yǎng)皿的底部，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，對培養(yǎng)皿底部有磁鐵區(qū)域(靶向區(qū))和無磁鐵區(qū)域(非靶向區(qū))用光學顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)。

1.2.8 DNM@MMZr微球的細胞劃痕實驗

marker筆在6孔板背后均勻畫出橫線，劃痕間隔0.5～1 cm，橫穿過孔。每孔穿5條線，將A549細胞鋪于24孔板，培養(yǎng)24 h后用槍頭比直尺于孔板背后的橫線劃痕，拍照。用PBS洗滌細胞3次，去除劃下的細胞，分別加入無血清培養(yǎng)液體與DNM@MMZr微球，培養(yǎng)24 h后，取出樣板，拍照。

1.2.9 DNM@MMZr微球的細胞存活率實驗

A549細胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h(7×103個/孔)，加入不同濃度的自由DNM或DNM@MMZr微球，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，除去MTT，加入150 μL DMSO，在避光下置恒溫搖床中振搖5 min，用酶標儀在490 nm波長下進行測定，檢測細胞存活率。

2 結果與討論

2.1 DNM@MMZr微球的表征

2.1.1 DNM@MMZr微球的物理表征

DNM@MMZr微球制備過程中的電極電位監(jiān)測結果見圖1?？梢姡判訤e3O4微球表面電位為-19.9 mV，二氧化鋯包埋后的MZr轉變?yōu)?1.24 mV，證明二氧化鋯的成功包埋；經(jīng)APTES修飾后，微球表面的氨基使電位升為15.6 mV；以丁二酸酐與氨基反應后，電位轉為-15.9 mV，證明磁性微球表面成功修飾了羧基。

DNM@MMZr微球的TEM結果見圖2?？梢?，納米粒子中黑色的Fe3O4磁核清晰可見，可以清楚觀察到其表面包覆的氧化鋯殼層，納米粒子近似球形，粒徑大小適中，分散性良好，很少有團聚現(xiàn)象，平均粒徑為100 nm左右。

以上結果表明化學包埋法制備MMZr載藥體系方法簡便，所制備的微球形貌規(guī)則，粒徑理想。

圖1 DNM@MMZr微球制備過程中的電極電位值變化

Figure 1 The Zeta potential change in the preparation process of DNM@MMZr microspheres

圖2 DNM@MMZr微球的TEM圖

Figure 2 TEM image of DNM@MMZr microspheres

2.1.2 DNM@MMZr微球的GSH刺激響應性及MMZr載體的生物相容性

DNM@MMZr微球對GSH的專一響應性釋放效率如圖3所示?？梢?，在8 mmol/L的GSH介質中，DNM@MMZr中的DNM在24 h后釋放率達到38.3%，而在其他溶質中，DNM的緩釋率低于10%，說明所制備的DNM@MMZr微球在細胞內源刺激響應對GSH具有專一性。由于腫瘤細胞中的GSH含量(10 mmol/L)高于正常細胞(4 mmmol/L)，表明DNM@MMZr微球可在細胞內用于GSH刺激響應控制藥物的釋放。

MMZr載體的生物相容性通過細胞毒性實驗予以評價，結果見圖4。結果表明，在載體質量濃度高達100 μg/mL時，對A549體系仍然沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，表明所制備的MMZr載體具有較高的生物安全性。

2.2 DNM@MMZr微球的細胞毒性評價

2.2.1 DNM@MMZr微球的磁靶向性能

將A549細胞與DNM@MMZr微球培養(yǎng)后，外加磁場，從圖5可見：在0 h時，靶向區(qū)域和非靶向區(qū)域幾乎沒有差別，培養(yǎng)皿內細胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好；而共孵育24 h后，非靶向區(qū)大部分細胞仍保持形態(tài)良好，但磁靶區(qū)的DNM@MMZr微球的濃度明顯增大，細胞大多變?yōu)樾鯛钇≡谂囵B(yǎng)皿中，這是細胞死亡的重要特征。這說明在外部磁場作用下，DNM@MMZr微球在磁靶向區(qū)域的聚集能力較強，對腫瘤細胞的殺傷增強。以上結果表明，微球中的磁核賦予了體系較強的磁靶向性，有望在外磁場的引導下，使該體系向腫瘤部位移動。

2.2.2 DNM@MMZr微球的抗細胞遷移性能

將A549細胞與DNM@MMZr微球共孵育0、24 h后，通過劃痕實驗來評價微球的抗細胞遷移性能，結果見圖6。可見，在共孵育24 h 后，空白組的細胞劃痕面積由8.96×104μm2降到3.871×104μm2，面積降低了56.8%；而加藥組的面積則由7.7153×104μm2降到6.56×104μm2，面積僅降低了14.9%。對比空白組，24 h后DNM@MMZr微球組細胞向劃痕中間遷移的能力明顯降低，說明DNM@MMZr微球對A549細胞的遷移具有明顯抑制作用，可有效減緩腫瘤細胞的侵襲。

圖3 DNM@MMZr微球在不同介質中的DNM釋放率

Figure 3 The DNM release ratios for DNM@MMZr microspheres in different solutions

圖4 不同MMZr載體濃度下細胞存活率

Figure 4 The cell viability in different concentations of MMZr

A、B. A549細胞與DNM@MMZr微球共孵育0 h； C、D. A549細胞與DNM@MMZr微球共孵育24 h。

圖5 A549細胞與DNM@MMZr微球在外磁場作用下共孵育后的形態(tài)變化

Figure 5 The morphology change of A549 cells treated with DNM@MMZr microspheres in the magnetic field

A、 B. A549細胞與MMZr分別共孵育0 h和24 h； C、D. A549細胞與DNM@MMZr微球分別共孵育0 h和24 h。

圖6 A549細胞與MMZr或DNM@MMZr微球共孵育后的遷移變化

Figure 6 The migrate change of A549 cells treated with MMZr or DNM@MMZr microspheres

2.2.3 DNM@MMZr微球的抗細胞增殖能力

用MTT法對比未固載的自由DNM和DNM@MMZr微球對A549細胞的抗細胞增殖能力，結果見圖7?？梢?，在濃度和孵育時間相同的條件下，DNM@MMZr微球表現(xiàn)出比自由DNM更高的腫瘤抑制效率，其中DNM@MMZr納米微球的IC50為0.40 μg/mL，而自由DNM的IC50值為0.68 μg/mL，說明所設計的納米微球可在安全運載DNM的基礎上，提高DNM的抗腫瘤效率。

圖7 A549細胞與自由DNM或DNM@MMZr微球共孵育48 h后的存活率

Figure 7 The viability change of A549 cells treated with free DNM (black) or DNM@MMZr (grey) microspheres for 48 h

3 結論

本文制備了以二氧化錳封堵的磁性氧化鋯納米體系并研究了體系對化療藥物DNM的運載和在腫瘤細胞內的控制釋放情況，結果表明所設計的體系具有較高的生物相容性、良好的磁靶向性和靈敏的GSH刺激響應性，且比自由DNM具有更高的體外抗肺癌活性，在抗腫瘤藥物的運載方面具有應用潛力。