于志軍，吳海根，林述勝，徐麗莉

(佛山市順德區(qū)伍仲珮紀念醫(yī)院，廣東 佛山 528300)

伏硫西汀分子式為C18H22N2S，化學(xué)名為1-[2-(2，4-二甲基-苯硫基)]苯基哌嗪，是一種多模式作用機制抗抑郁藥物，通過提高腦中5-羥色胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)傳遞功能產(chǎn)生抗抑郁療效[1-4]，可顯著改善認知癥狀，其認知癥狀改善作用獨立于情感癥狀的改善[5]。伏硫西汀口服后吸收緩慢而良好，在7～11 h血藥濃度達峰值，絕對生物利用度為75%，約2周達穩(wěn)態(tài)血藥濃度，食物對其體內(nèi)藥動學(xué)無影響[4]。關(guān)于伏硫西汀原料藥、制劑含量測定已有報道[6-7]，但對其血藥濃度與藥動學(xué)研究較少，且測定結(jié)果易受代謝物與結(jié)構(gòu)類似物干擾。為滿足臨床對伏硫西汀藥動學(xué)和治療藥物監(jiān)測需求，本文采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，用蛋白沉淀法對樣本進行前處理，建立一種簡便、快速測定人血清中伏硫西汀濃度的方法。

1 儀器與試藥

伏硫西汀對照品(批號：1-JSC-75-4，質(zhì)量分數(shù)99.56%，加拿大TRC公司)；伏硫西汀-D8對照品(批號：2-GAC-69-2，質(zhì)量分數(shù)99.1%，加拿大TRC公司)；甲酸銨(質(zhì)譜純，美國Fisher公司)；甲醇(色譜級，德國Merck公司)；實驗用水(超純水，電阻率=18 MΩ)。

LC-20A高效液相色譜儀、LCMS-8040三重四級桿質(zhì)譜檢測器均為日本島津公司產(chǎn)品；MS3basic渦旋器(德國 IKA)；SQP-SECURA125-1CN型電子分析天平(德國 Sartorius)；H2050R高速離心機(湖南湘儀儀器有限公司)；超純水純化系統(tǒng)(四川沃特爾設(shè)備有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Shim-pack VP-ODS(2.0 mm×15 cm，5 μm)；流動相為甲醇-5 mmoL/L甲酸銨緩沖溶液(體積比75∶25)；流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，正離子掃描模式，脫溶劑管溫度為250 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃，干燥氣為氮氣，流速為15.0 L/min。用多反應(yīng)監(jiān)測模式，定量分析離子對分別為m/z299.15→m/z150.10(伏硫西汀)、m/z307.25→m/z153.10(伏硫西汀-D8)，碰撞能量分別為22.0、25.0 eV。伏硫西汀及伏硫西汀-D8質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品工作液的制備 取伏硫西汀對照品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的對照品儲備液。取對照品儲備液適量，用50%(體積分數(shù)，下同)甲醇稀釋得質(zhì)量濃度分別為20、40、400、800、1 200、1 600、2 000 ng/mL的標準曲線工作液。

圖1 伏硫西汀(A)及內(nèi)標伏硫西汀-D8(B)質(zhì)譜圖

Figure 1 Vortioxetine (A) and internal standard Vortioxetine-D8 (B) mass spectrometry

2.2.2 內(nèi)標工作液的制備 精密稱取內(nèi)標伏硫西汀-D8對照品適量，以甲醇為溶劑配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的儲備液，用50%甲醇稀釋得質(zhì)量濃度為100 ng/mL的內(nèi)標工作液。

2.2.3 標準曲線和質(zhì)控樣品的制備 精密量取20、40、400、800、1 200、1 600、2 000 ng/mL的伏硫西汀標準曲線工作液5 μL至2 mL EP管中，加入95 μL空白血清，渦旋30 s，得質(zhì)量濃度分別為2、4、40、80、120、160、200 ng/mL的伏硫西汀標準曲線樣品。同法制備定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度的血清質(zhì)控樣品，伏硫西汀的質(zhì)量濃度分別為2、6、60、150 ng/mL。

2.3 血清樣品處理

取血清樣品100 μL于2 mL EP管中，加入內(nèi)標工作液20 μL，渦旋15 s，加入沉淀劑乙腈500 μL，渦旋1 min，以14 650 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液100 μL至進樣瓶。

2.4 專屬性試驗

分別取6份不同來源的未服用過伏硫西汀的正常人空白血清100 μL，不加內(nèi)標，按“2.3”項血清樣品處理方法處理，按“2.1”項條件進樣分析，得空白樣品色譜圖。另取空白血清3份，分別加入伏硫西汀、伏硫西汀-D8及伏硫西汀+伏硫西汀-D8，按“2.3”項下方法處理，得色譜圖見圖2?？梢姡蛭魍∨c伏硫西汀-D8的保留時間分別約為1.15 min和1.13 min，血清中內(nèi)源性物質(zhì)對目標分析物及其對應(yīng)內(nèi)標的測定無干擾，專屬性好。

A.空白血清； B.添加伏硫西汀血清； C.添加內(nèi)標血清； D.添加伏硫西汀及內(nèi)標血清。

圖2 專屬性試驗MRM圖
Figure 2 MRM of Specific test

2.5 標準曲線與檢出限

按“2.2.3”項制備標準曲線血清樣品，按“2.1”項條件進樣分析。以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標(y)，采用加權(quán)(1/x2)最小二乘法進行回歸，得到伏硫西汀的標準曲線方程為y=5.61x-1.17×10-3(r2=0.996 8)，定量下限為2 ng/mL，線性范圍為2～200 ng/mL。

2.6 精密度與提取回收率試驗

取“2.2.3”項下定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度(2、6、60、150 ng/mL)的血清質(zhì)控樣品100 μL，每個質(zhì)量濃度6份樣品，按“2.3”項血清樣品處理方法處理，按“2.1”項條件進樣分析，求得方法批內(nèi)精密度和準確度。連續(xù)測定3 d，并與隨行標準曲線同時測定，求得方法批間精密度。取低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各100 μL，按“2.3”項血清樣品處理方法處理后進樣的峰面積記為A，空白樣品同法處理后、加入相應(yīng)濃度的對照品溶液進樣后的峰面積記為B，每組每個質(zhì)量濃度6份樣品，提取回收率=A/B×100%。

按《中國藥典》中“9012生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則”要求計算精密度和準確度，得伏硫西汀的批內(nèi)精密度為2.61%～4.53%，批間精密度為0.83%～1.97%，準確度為95.48%～103.53%。在低、中、高3種濃度下，伏硫西汀的平均提取回收率為91.93%～97.26%，精密度與回收率均符合方法學(xué)驗證要求，結(jié)果見表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下低、中、高質(zhì)量濃度(6、60、150 ng/mL)的血清質(zhì)控樣品，分別考察在常溫避光放置1 h和24 h、反復(fù)凍融1次和3次、-70 ℃凍存1 d和14 d的穩(wěn)定性。結(jié)果表明質(zhì)控樣品在常溫光照條件下放置24 h、反復(fù)凍融3次、-70 ℃凍存7 d和14 d各條件下均穩(wěn)定，RSD均小于15%，可見血清樣品在各條件下均保持穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表1 血清中伏硫西汀的精密度與回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of precision and recovery for vortioxetine in serum

表2 樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 Results of the stability of the samples (n=3)

2.8 基質(zhì)效應(yīng)

分別取6種不同來源的空白血清95 μL，按“2.3”項下血清樣品處理方法處理，得空白基質(zhì)后，分別加入低、高(含伏硫西汀6、150 ng/mL)質(zhì)量濃度工作液5 μL與內(nèi)標溶液20 μL，制備成基質(zhì)考察樣品，進樣分析，得分析物與內(nèi)標峰面積比值A(chǔ)1。用去離子水代替血清，同法操作，得分析物與內(nèi)標峰面比值A(chǔ)2。每份血清樣品每個濃度重復(fù)制備2份，計算內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子=A1/A2×100%的RSD值。結(jié)果伏硫西汀在低、高2個質(zhì)量濃度水平下的內(nèi)標歸一化基質(zhì)因子RSD分別為 9.01%、2.77%，均小于15%，表明該方法無明顯基質(zhì)影響。

2.9 方法學(xué)應(yīng)用

采用本方法測定13例未知濃度待測含藥血漿樣品，其中1例的質(zhì)量濃度低于定量下限，12例的質(zhì)量濃度均在標準曲線濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度范圍為3.5～33.2 ng/mL，平均質(zhì)量濃度為16.35 ng/mL，與神經(jīng)精神藥理學(xué)治療藥物監(jiān)測共識指南(AGNP)[8]推薦的治療濃度范圍(10～40 ng/mL)相一致，表明大部分患者所服用的伏硫西汀達到有效濃度范圍。

3 討論

伏硫西汀作為新型抗抑郁藥，被美國精神病學(xué)抑郁癥治療指南、加拿大情緒和焦慮治療網(wǎng)絡(luò)成人抑郁癥管理指南和中國抑郁障礙防治指南等推薦為治療抑郁癥的一線藥物，在AGNP指南中伏硫西汀作為2級推薦，臨床需要時可進行治療藥物監(jiān)測。采用LC-MS/MS測定人血清中藥物濃度的方法有較多的研究[9-10]，但有關(guān)伏硫西汀的血藥濃度監(jiān)測方法文獻報道較少。

本研究旨在建立一種操作簡單、靈敏度高、準確穩(wěn)定地檢測人血清中伏硫西汀的方法。在色譜條件摸索中發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例增加，響應(yīng)增強，采用甲醇-水(體積比75∶25)的流動相體系，可減少流動相對儀器的損傷。采用乙腈蛋白沉淀法對樣品進行處理，不但提高了靈敏度，而且有利于改善峰型。本文方法是在文獻[11]方法學(xué)條件下進行了優(yōu)化，緩沖溶液中甲酸銨濃度由原來2×104mmoL/L改成5 mmoL/L，流速由1 mL/min改成0.4 mL/min，結(jié)果顯示定量下限可達 2 ng/L，分析時間縮短10 min，且具有更高的回收率(91.93%～97.26%)和更少的進樣量(1 μL)，分離效果良好，可快速對臨床樣品進行高通量定量分析，能夠滿足臨床血藥濃度監(jiān)測的要求。