胡軍華，陳茜，秦浩龍，張睿，譚文

(廣東工業(yè)大學生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

吸入制劑是治療肺部疾病的首選劑型。目前，吸入制劑有水霧劑、干粉吸入劑和氣霧劑3種類型[1]。與干粉吸入劑和氣霧劑相比，在使用水霧劑時不需要患者刻意配合，可持續(xù)和更大劑量給藥，適合兒童和病情較重患者使用[1-4]。水霧劑需要借助霧化裝置產生氣溶膠后才能被患者吸入。根據霧化原理的不同，可以將霧化裝置分為空氣壓縮霧化器、超聲霧化器和篩網振動霧化器3類[5-7]。在確定處方后，水霧劑的遞送性能主要由所選的裝置決定[8]。

吸入制劑的粒徑及粒徑分布是影響藥物氣溶膠在肺部沉積部位的主要因素。文獻報道，5 μm以上的藥物粒子主要在口咽部沉積，2～3 μm的藥物粒子能沉積到肺泡，小于1 μm的藥物粒子容易隨著呼氣氣流呼出體外[9-11]。目前，《中國藥典》2015年版推薦的用于吸入劑粒徑及粒徑分布測試的方法主要有碰撞法和激光衍射法[12]。在使用碰撞法測試水霧劑的粒徑及粒徑分布時，測試流速是(15±0.75)L/min，并且在恒定流速條件下進行測試[12]。激光衍射法的測試條件與碰撞法的相同[13]。但是，以上這種測試條件與吸入劑臨床使用時的氣流環(huán)境不相符合。因此，有必要探究在接近臨床使用條件下的吸入制劑的粒徑及分布情況，對于藥物處方開發(fā)和裝置選擇具有重要意義。在進行霧化吸入劑遞送速率和遞送總量的測試中，《中國藥典》推薦的成人呼吸模式為：潮氣量500 mL，呼吸頻率 15次/min，吸氣和呼氣的比值1∶1[12]。顯然這種呼吸模式并不能代表呼吸功能下降病人的呼吸模式，如慢性阻塞性肺病和肺纖維化的患者。有文獻表明，當吸氣時間與呼吸循環(huán)總時間的比值(Ti/Ttotal)小于0.4時，可以認為該呼吸模式存在氣道阻塞的情況[14-15]。另外，對于呼吸功能減弱的患者，往往也表現出呼吸頻率加快，潮氣量降低的特點。

異甜菊醇鈉(isosteviol sodium，STVNa)是一種對心肌肥大、肺動脈高壓和腦卒中等心腦血管疾病有治療作用的藥物[16]。本實驗室已開發(fā)出了異甜菊醇鈉的霧化吸入劑，用于治療肺纖維化。藥物氣溶膠在呼吸系統(tǒng)的沉積部位與藥物氣溶膠顆粒的粒徑和分布密切相關[9-10]，在吸入制劑粒徑分布的體外評價中，現有測試方法能否充分體現在疾病狀態(tài)下的粒徑及分布情況，尚未有文獻報道。由于多級碰撞器只能在恒定流速下進行測試，在動態(tài)呼吸模式下無法正常工作。因此，本研究以STVNa霧化吸入劑為測試藥品，參考前期研究的方法[8,17]，將激光粒度儀與呼吸模擬器串聯(lián)，探究呼吸模式對水霧劑粒徑分布的影響。

1 儀器與材料

新帕泰克HELOS激光粒度儀(德國新帕泰克公司)；BRS2000呼吸模擬器(英國Copley公司)；Certifier?FA plus呼吸模式驗證儀(美國TSI公司)；百瑞空氣壓縮泵(Pari?BOY SX，德國百瑞公司)；Pari?LC sprint噴射霧化器(紅芯和藍芯，德國百瑞公司)；Aeroneb Pro主動型篩網振動霧化器(美國Aerogen公司)和Omron microAir NE-U22被動型篩網振動霧化器(日本歐姆龍公司)；Milli Pore Advantage A10自動純水機(美國默克公司)。

STVNa霧化吸入溶液(2 mg/mL，自制)；生理鹽水(批號：19081706F，河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司)；藥用級乙醇(批號：E1931154，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；1,2-丙二醇(批號：20171008，天津市大茂化學試劑廠)。

2 方法

2.1 呼吸模擬器和激光粒度儀的串聯(lián)

參照先前的研究[8,17]，將呼吸模擬器和激光粒度儀串聯(lián)起來，儀器連接如圖1所示，使用呼吸模擬器模擬不同吸氣時間和不同潮氣量的呼吸模式，呼吸模式設置見表1。在呼吸模擬器上設置好呼吸模式的各項參數，如潮氣量(Tidal volume，TV)、呼吸頻率(Frequency，F)，以及吸氣時間占呼吸周期的比值(Duty cycle，Ti/Ttotal)。每個呼吸模式對應的平均吸氣流速按照以下公式計算：

當呼吸模擬器按照設定的呼吸模式運行時，在激光粒度儀進樣池的進氣口使用呼吸模式驗證儀來驗證各項呼吸參數是否在可接受區(qū)間內。

圖1 呼吸模擬器和激光粒度儀裝置串聯(lián)圖

Figure 1 Series diagram of respiratory simulator and laser diffractometer

表1 呼吸模式設置參數Table 1 Setting parameters of breathing patterns

*呼吸模式1指的是《中國藥典》選用的模式。

2.2 不同呼吸模式下的粒徑分布測試

在吸氣階段時，霧化器產生的藥物氣溶膠隨著吸氣氣流進入激光粒度儀的進樣池。激光粒度儀每20 ms采集1個信號，利用費氏模型來分析激光的衍射數據。WINDOX 數據軟件自動計算出基于體積權重的粒徑分布結果。其粒徑分布的表達參數包括：X(10)，表示粒徑比該值小的粒子占10%；X(50)，表示粒徑比該值小的粒子占50%；以及X(90)，表示粒徑比該值小的粒子占90%。按照以下公式計算出衡量粒徑分布跨度的指標(Span)：

在激光粒度儀測試區(qū)的藥物霧滴的量由光學濃度(Copt，optical concentration)來表征。其計算公式如下：

其中，I0表示在沒有樣品經過測試區(qū)域時，在檢測器中心的光學強度；Ip表示在有樣品經過測試區(qū)域時，在檢測器中心的光學強度[17]。在測試區(qū)域的藥物霧滴的量與光學濃度呈正相關。

4種霧化器分別加入2 mL的STVNa霧化吸入溶液，持續(xù)霧化1 min。每個霧化器至少測試3次。將吸氣段的粒徑分布結果進行統(tǒng)計分析。

2.2 統(tǒng)計分析

3 結果

3.1 不同霧化器在不同吸氣時間下的粒徑分布結果

使用不同霧化器在不同吸氣時間段的粒徑結果如表2～表5所示。當使用篩網振動霧化器時，Ti/Ttotal=0.3時的粒徑分布X(50)值和Span值與Ti/Ttotal=0.5的結果相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而Ti/Ttotal=0.4的結果與Ti/Ttotal=0.5的結果相比，差異沒有統(tǒng)計學意義。與篩網振動霧化器得到的結果不同，使用空氣壓縮霧化器[Pari LC sprint(藍芯)和Pari LC sprint(紅芯)]時，在Ti/Ttotal=0.4和Ti/Ttotal=0.3的吸氣段內，粒徑分布X(50)值和Span值與Ti/Ttotal=0.5的結果相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

表2 使用Aeroneb Pro 霧化器得到的粒徑參數Table 2 Results of particle size obtained by Aeroneb Pro nebulizer

與Ti/Ttotal=0.5比較：**P<0.01。

表3 使用Omron microAir NE-U22 霧化器得到的粒徑參數Table 3 Results of particle size obtained by Omron microAir NE-U22 nebulizer

與Ti/Ttotal=0.5比較：*P<0.05,**P<0.01。

表4 使用Pari LC sprint(藍芯)霧化器得到的粒徑參數Table 4 Results of particle size obtained by Pari LC sprint (blue)

與Ti/Ttotal=0.5比較：*P<0.05,**P<0.01。

表5 使用Pari LC sprint(紅芯)霧化器得到的粒徑參數Table 5 Results of particle size obtained by Pari LC sprint (red)

與Ti/Ttotal=0.5比較：*P<0.05,**P<0.01。

3.2 不同霧化器在不同吸氣時間下的粒徑累積分布結果

圖2-5是使用不同霧化器在不同吸氣時間段得到的顆粒粒徑累積分布結果。可見，使用Aeroneb Pro霧化器時，在不同的吸氣時間段內，3個粒徑區(qū)間(<3 μm、3～5.25 μm和>5.25 μm)的累積分布結果的差異無統(tǒng)計學意義。使用Omron microAir NE-U22霧化器時，在Ti/Ttotal=0.3的吸氣段內，3個粒徑區(qū)間的累積分布結果與在Ti/Ttotal=0.5的結果相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且在<3 μm粒徑區(qū)間內，粒徑累積分布呈上升趨勢。同時，在3～5.25 μm和>5.25 μm粒徑區(qū)間內，粒徑累積分布呈下降趨勢。然而，在Ti/Ttotal=0.4時，3個粒徑區(qū)間的結果與在Ti/Ttotal=0.5的結果相比差異沒有統(tǒng)計學意義。

與篩網振動霧化器得到的結果不同，使用空氣壓縮霧化器(Pari LC sprint(藍芯)和Pari LC sprint(紅芯))時，在Ti/Ttotal=0.4和Ti/Ttotal=0.3時，3個粒徑區(qū)間(<3 μm、3～5.25 μm和>5.25 μm)的累積分布結果與在Ti/Ttotal=0.5的結果差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。并且，隨著吸氣時間的縮短，在<3 μm粒徑區(qū)間內，粒徑累積分布呈下降趨勢；在3～5.25 μm和>5.25 μm粒徑區(qū)間內，粒徑累積分布分別呈上升趨勢。

圖2 使用Aeroneb Pro 霧化器得到的粒徑累積分布

Figure 2 Cumulative particle size distribution obtained by Aeroneb Pro nebulizer

3.3 不同霧化器不同潮氣量下的粒徑分布結果比較

使用不同霧化器在不同潮氣量下的粒徑結果見表6?？梢?，當Ti/Ttotal=0.3，使用Aeroneb Pro霧化器時，潮氣量為400 mL時的中位粒徑結果X(50)與潮氣量為500 mL和600 mL時的結果相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而使用Omron NE-U22霧化器時，只有潮氣量為500 mL時的中位粒徑結果X(50)與潮氣量為600 mL時的結果相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對于空氣壓縮霧化器，使用Pari LC sprint(藍芯)霧化器時，3種潮氣量下得到的中位粒徑結果的差異均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而使用Pari LC sprint(紅芯)霧化器時，3種潮氣量下得到的中位粒徑結果的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Ti/Ttotal=0.5比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖3 使用Omron microAir NE-U22 霧化器得到的粒徑累積分布

Figure 3 Cumulative particle size distribution obtained by Omron microAir NE-U22 nebulizer

當Ti/Ttotal=0.4，使用Aeroneb Pro霧化器時，潮氣量為500 mL時的中位粒徑結果X(50)與潮氣量為400 mL和600 mL時的結果相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而在使用Omron NE-U22霧化器時，3種潮氣量下得到的中位粒徑結果的差異均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對于空氣壓縮霧化器，其結果與當Ti/Ttotal=0.3時的結果類似，使用Pari LC sprint(藍芯)霧化器時，3種潮氣量下得到的中位粒徑結果的差異均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而使用Pari LC sprint(紅芯)霧化器時，3種潮氣量下得到的中位粒徑結果的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

與Ti/Ttotal=0.5比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖4 使用Pari LC sprint(藍芯)霧化器得到的粒徑累積分布

Figure 4 Cumulative particle size distribution obtained by Pari LC sprint nebulizer (blue)

與Ti/Ttotal=0.5比較：*P<0.05,**P<0.01。

圖5 使用Pari LC sprint(紅芯)霧化器得到的粒徑累積分布

Figure 5 Cumulative particle size distribution obtained by Pari LC sprint nebulizer (red)

表6 不同霧化器不同潮氣量下的X(50)值Table 6 X(50) under different tidal volumes by different

注：不同字母代表差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，相同字母代表差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

4 討論

藥物氣溶膠的粒徑及分布是經口吸入劑的重要質量屬性，在霧化吸入劑開發(fā)的過程中必須嚴格控制。影響藥物氣溶膠粒徑及分布的主要因素有以下3種：(1)藥物溶液的理化性質，如黏度和表面張力[18-19]；(2)霧化裝置的原理和粒徑區(qū)間；(3)患者的疾病狀態(tài)和呼吸道的生理構造的差異[9,20]。目前，各國藥典均已規(guī)定了吸入制劑粒徑及分布測試的方法，但測試方法均只在單一的條件下進行測試，所推薦的測試條件并沒有和患者在使用吸入制劑時的呼吸狀態(tài)相一致。雖然，覆蓋所有的呼吸狀態(tài)是不現實的，也是不具有可操作性的。但是，規(guī)定或推薦幾種能代表不同疾病狀態(tài)下的呼吸模式，并在這一呼吸模式下評價藥物氣溶膠的粒徑及分布，其體外評價的結果可能會更接近臨床使用的情形。本課題組前期研究結果表明，霧化吸入劑的遞送量與呼吸模式的平均吸氣流速有關[8]。為保證足夠多的藥物能夠被遞送進肺部，推薦患者采用“深而慢”的呼吸模式[8]。研究表明，有呼吸道阻塞的患者，往往吸氣時間短，同時潮氣量降低[21]。

本研究中，探究了吸氣時間和潮氣量對霧化吸入劑粒徑及分布的影響。設定了3個不同的吸氣時間段：Ti/Ttotal=0.3和Ti/Ttotal=0.4的呼吸模式，代表患者在疾病狀態(tài)下的吸氣時間；Ti/Ttotal=0.5為《歐洲藥典》、《美國藥典》和《中國藥典》推薦標準。另外，設定了600、500、400 mL 3個不同的潮氣量，代表在疾病狀態(tài)下可能出現的潮氣量的變化。研究結果表明，粒徑分布的差異不僅與呼吸模式有關，同時也與所選的霧化裝置有關。在使用空氣壓縮霧化器時，隨著吸氣時間的縮短，藥物氣溶膠的粒徑值會有變大的趨勢；而在使用篩網振動霧化器時，隨著吸氣時間的縮短，藥物氣溶膠的粒徑值反而有變小的趨勢?？諝鈮嚎s霧化器的原理表明，空氣氣流參與霧滴的產生和運輸的過程[6]，而篩網振動霧化器的霧滴的產生并不需要空氣氣流的參與，空氣氣流僅僅在藥物的運輸過程中產生影響[22]。由于空氣的引入而產生的蒸發(fā)效應的程度，與氣溶膠的霧滴量有關[22]。在本研究中，空氣壓縮霧化器產生的霧滴量要高于篩網振動霧化器產生的霧滴量。因此，在使用篩網振動霧化器時，由于空氣氣流而產生的蒸發(fā)效應導致霧滴粒徑縮小。而在使用空氣壓縮霧化器時，產生的霧滴量高，在氣溶膠范圍內的濕度較高。因此，小顆粒更容易由于蒸發(fā)效應而消失，從而使小顆粒的比重降低，使粒徑分布向粒徑偏大的方向轉移。

霧化吸入制劑的粒徑及分布與藥物氣溶膠在肺部的沉積密切相關，在霧化吸入劑開發(fā)的過程中需要建立與臨床使用相關聯(lián)的評價方法，從而讓體外評價的結果更好地指導臨床應用。