徐亞楠，徐立娜

1. 中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，青島 266100 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，青島 266100

石墨烯(graphene)是一種重要的二維碳納米材料，具有非常穩(wěn)定的碳結(jié)構(gòu)[1-2]。近年來，石墨烯依靠本身獨特的電學(xué)性質(zhì)[3]、光學(xué)性質(zhì)[4]、機械性能[5]及巨大的比表面積[6]，在電池、電子設(shè)備、生物醫(yī)藥、材料和儲能等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7-8]。隨著石墨烯材料及其相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)、儲存、運輸、使用、清理和廢棄等過程，石墨烯不可避免地會釋放到環(huán)境中，對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定的威脅[9]。因此，了解石 墨烯材料的健康和生態(tài)風(fēng)險對石墨烯材料的安全應(yīng)用至關(guān)重要。

植物作為生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，其多樣性對生態(tài)系統(tǒng)的平衡至關(guān)重要。目前已有諸多研究表明，石墨烯材料對植物生長存在毒性效應(yīng)。例如，Begum等[10]通過研究石墨烯對卷心菜、番茄和紅莧菜幼苗生長的影響，發(fā)現(xiàn)石墨烯能夠抑制植物生長，并對植物根部產(chǎn)生物理損傷及氧化損傷。Hao等[11]的研究表明，還原氧化石墨烯對水稻莖高和根長產(chǎn)生抑制效應(yīng)，并顯著降低根皮質(zhì)細(xì)胞直徑，導(dǎo)致細(xì)胞收縮變形。Zhang等[12]研究了石墨烯對番茄幼苗生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石墨烯能夠滲透入液泡及在根尖沉積，從而抑制生物量的積累。然而，也有文獻(xiàn)表明，石墨烯對植物生長具有促進(jìn)作用。例如，通過調(diào)節(jié)赤霉素(GA)的生物合成促進(jìn)幼苗根和莖的生長[12]。綜上所述，關(guān)于石墨烯植物毒性的研究還存在爭議。并且，石墨烯對單子葉植物和雙子葉植物影響的研究還較為缺乏。

黃瓜和玉米是典型的雙子葉和單子葉植物，其作為廣泛種植的經(jīng)濟作物，已被廣泛地用作納米顆粒的毒理學(xué)研究。但目前關(guān)于石墨烯對黃瓜和玉米幼苗毒性效應(yīng)的研究尚未有報道?；诖?，本文以雙子葉子植物黃瓜和單子葉植物玉米作為受試植物，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)實驗研究石墨烯對植物幼苗生長的影響，并探究其對植物生長產(chǎn)生抑制的機理，為石墨烯的環(huán)境風(fēng)險評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 石墨烯的特性表征

實驗采用的石墨烯購于美國石墨烯公司(American Graphene Supermarket Co. Ltd.)，純度>99.9%。將5 mg石墨烯懸浮于100 mL無水乙醇中，利用超聲清洗機超聲分散(100 W, 40 kHz) 1 h。取配制的溶液滴加到銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干，利用透射電子顯微鏡(TEM) (JEM-2100，JEOL，日本)觀察石墨烯的形態(tài)。取配制的溶液滴加到云母載玻片上，自然風(fēng)干，使用原子力顯微鏡(AFM) (Agilent5400，Agilent Technologies Co.，美國)觀察并分析石墨烯的厚度。稱取5 mg干燥的石墨烯樣品過60目篩，利用元素分析儀(Vario Elemental Analyzer，Elementar，德國)測定碳(C)、氧(O)、硫(S)、氫(H)和氮(N)元素的含量。利用傅立葉紅外光譜儀(FTIR) (Nicolet6700，Thermo Fisher Scientific Inc., 美國)測量石墨烯表面含有的官能團。利用全自動物理化學(xué)吸附儀(Autosorb-1，Quantachrome，美國)，使用Brunauere-Emmette-Teller (BET)方法測得石墨烯的比表面積。稱取5 mg石墨烯，分別加入到100 mL蒸餾水、1/4單子葉營養(yǎng)液和1/4雙子葉營養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)pH值在6.5～7.0之間，超聲分散1 h，制備成50 mg·L-1的石墨烯懸浮液，利用粒度分析儀(Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments Ltd，英國)測量其Zeta電位。配制2 000 mg·L-1石墨烯懸浮液，黑暗中靜置7 d后10 000 r·min-1條件下高速離心，用0.22 μm一次性針頭濾器(聚醚砜(PES)膜，美侖)過濾，之后利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)(Agilent 7500，Agilent Technologies，美國)測定濾液中石墨烯釋放的離子濃度，用蒸餾水作為對照。

1.2 植物幼苗培養(yǎng)及處理方法

實驗所用的黃瓜和玉米種子購于山東省青島市城陽種子站，種子的發(fā)芽率大于90%。挑選大小一致、顆粒飽滿的黃瓜和玉米種子，用10% H2O2對種子進(jìn)行消毒10 min，蒸餾水沖洗3遍，將種子放置到鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，7 d后選擇長勢一致的黃瓜幼苗和玉米幼苗分別移入培養(yǎng)盆中，分別加入1/4雙子葉營養(yǎng)液(K2SO4，32.68 mg·L-1；Ca(NO3)2，118.08 mg·L-1；MgSO4·7H2O，40.05 mg·L-1；KH2PO4，8.51 mg·L-1；KCl，1.86 mg·L-1；Fe-EDTA，10.53 mg·L-1；MnSO4·H2O，0.042 mg·L-1；CuSO4·5H2O，0.006 mg·L-1；ZnSO4·7H2O，0.072 mg·L-1；(NH4)6Mo7O24，0.015 mg·L-1；H3BO3，0.154 mg·L-1)和1/4單子葉營養(yǎng)液(K2SO4，32.68 mg·L-1；Ca(NO3)2，118.08 mg·L-1；MgSO4·7H2O，40.05 mg·L-1；KH2PO4，8.51 mg·L-1；KCl，1.86 mg·L-1；Fe-EDTA，10.53 mg·L-1；MnSO4·H2O，0.042 mg·L-1；CuSO4·5H2O，0.006 mg·L-1；ZnSO4·7H2O，0.072 mg·L-1；(NH4)6Mo7O24，0.015 mg·L-1；H3BO3，0.015 mg·L-1)。每天光照12 h，光照強度16 500 lx；20～25 ℃/15～20 ℃(白天/夜晚)；濕度保持在60%～70%左右；持續(xù)曝氣。植物幼苗在長至兩葉一心時，進(jìn)行石墨烯暴露處理。實驗設(shè)置了7個不同的處理組，即去離子水空白對照(CK)與10、50、100、500、1 000和2 000 mg·L-1石墨烯處理，每個處理均設(shè)置5個重復(fù)。每隔5 d更換一次營養(yǎng)液，并重新加入石墨烯懸浮液，處理時間持續(xù)15 d。每隔3 d從每個處理組里面選取5棵長勢一致的植物，測量株高；用全自動根系掃描分析儀(WinRHIZO Pro.2005b，加拿大)掃描，分析根長、根尖數(shù)和葉面積；用電子天平稱量鮮重。將植物放入105 ℃的烘箱中進(jìn)行殺青處理，再放置到65 ℃烘箱中進(jìn)行24 h烘干，之后稱量植物的干重。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)繪制植物生長曲線。

1.3 物理損傷測定

取1 000 mg·L-1石墨烯處理過的黃瓜和玉米幼苗的根部，用蒸餾水沖洗干凈，用pH=7.2的磷酸緩沖液(PBS)沖洗2次，將根系分散于2.5%的戊二醛中固定12 h，然后再用PBS沖洗3次，加入戊二醛中二次固定，乙醇分級脫水，叔丁醇包埋，冷凍干燥，噴金處理，利用掃描電子顯微鏡(SEM，S-4800，Hitachi，日本)進(jìn)行觀察。

1.4 氧化損傷測定

取1 000 mg·L-1石墨烯處理15 d的新鮮植物幼苗，按照1∶9的體積比加入生理鹽水，冰浴條件下用勻漿機進(jìn)行勻漿。取上清液，采用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)探針測量植物體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基(ROS)含量；采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)測定丙二醛(MDA)，利用酶標(biāo)儀(MultiskanFC, Thermo Fisher Scientific Inc., 美國)在532 nm處測定吸收峰，計算反應(yīng)產(chǎn)物。

1.5 營養(yǎng)耗竭實驗

稱取0.05 g石墨烯加入50 mL 1/4雙子葉營養(yǎng)液或者1/4單子葉營養(yǎng)液(pH 6.5～7.0)，超聲分散，配制成1 000 mg·L-1石墨烯懸浮液，放置在黑暗環(huán)境中5 d，5 d后高速離心(10 000 rmin-1)分離，用0.22 μm一次性針頭濾器過濾，利用ICP-MS測定營養(yǎng)液中的離子濃度，用蒸餾水作為對照。并用凱氏定氮儀測定溶液中總氮含量。利用鉬酸銨分光光度法測定營養(yǎng)液中總磷含量的變化。

在營養(yǎng)液中加入石墨烯，石墨烯的濃度分別為50、100、500和1 000 mg·L-1，將營養(yǎng)液放置5 d，過濾取其上清液，利用上清液培養(yǎng)植物，每5天換一次營養(yǎng)液。植物培養(yǎng)15 d后，測量植物株高、地上部/根部鮮重和干重、根長、根尖數(shù)以及葉面積參數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

所有處理至少有3個重復(fù)，結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用Microsoft Excel 2013軟件，利用DPS12.5軟件中的單因素方差分析(Analysis of Variance，ANOVA，LSD檢驗法)進(jìn)行顯著性差異檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 石墨烯的特性表征

圖1 石墨烯(a)透射電子顯微鏡(TEM)照片和(b)原子力顯微鏡(AFM)照片F(xiàn)ig. 1 (a) Transmission Electron Microscope (TEM) image of graphene sheets; (b) Atomic Force Microscopy (AFM) image of graphene sheets

2.2 石墨烯對黃瓜和玉米幼苗的毒性效應(yīng)

在營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，不同濃度的石墨烯(0、10、50、100、500、1 000和2 000 mg·L-1)懸浮液處理植物15 d后，黃瓜和玉米生長的各參數(shù)的變化曲線分別如圖2和圖3所示。石墨烯能夠抑制植物幼苗的生長，且隨著石墨烯濃度以及暴露時間的增加，對黃瓜和玉米幼苗的毒性也明顯增強。對于黃瓜幼苗，在第15天，2 000 mg·L-1石墨烯處理組與對照組相比，根部鮮重和干重都減少了86%(圖2(a)和圖2(b))，地上部鮮重和干重分別減少了77%(圖2(c))和76%(圖2(d))。對于玉米幼苗，2 000 mg·L-1石墨烯處理組與對照組相比，根鮮重和干重分別減少了40%(圖3(a))和33%(圖3(b))，其地上部生物量沒有發(fā)生顯著性變化(圖3(c)和圖3(d))。與對照相比，石墨烯處理顯著降低了根長和根尖數(shù)以及株高和葉面積，且抑制效應(yīng)也都存在著時間和濃度效應(yīng)。

圖2 石墨烯對黃瓜幼苗的影響Fig. 2 Effects of graphene on the growth of cucumber seedlings

2 000 mg·L-1石墨烯處理植物幼苗15 d，黃瓜根長、根尖數(shù)、株高和葉面積分別減少了90%(圖2(e))、84%(圖2(f))、36%(圖2(g))和72%(圖2(h))。玉米根長、根尖數(shù)、株高和葉面積分別減少了33%(圖3(e))、36%(圖3(f))、7.8%(圖3(g))和29%(圖3(h))。以上實驗結(jié)果表明，與玉米幼苗相比，黃瓜幼苗對石墨烯更加敏感。

2.3 物理損傷

石墨烯具有鋒利的邊緣，與植物根系接觸可能會對植物造成物理損傷。使用SEM觀察黃瓜和玉米根系(圖4和圖5)發(fā)現(xiàn)：石墨烯處理過的黃瓜(圖4(b))根冠有明顯的切割傷痕；未處理的黃瓜成熟區(qū)(圖4(c))表面光滑、有根毛，石墨烯處理過的黃瓜成熟區(qū)(圖4(d))表面有明顯的切割痕跡。這說明，石墨烯能夠通過切割作用對植物幼苗根系造成直接的物理損傷。Begum等[10]在研究中觀察到石墨烯對卷心菜、番茄、紅莧菜和生菜根部造成物理損傷，出現(xiàn)表皮脫落的現(xiàn)象。對于玉米幼苗，未處理的玉米幼苗根部較細(xì)，根冠和根成熟區(qū)較為光滑(圖5(a)和圖5(c))，與對照相比，1 000 mg·L-1石墨烯處理過的玉米根冠(圖5(b))和成熟區(qū)(圖5(d))變粗受損。

圖3 石墨烯對玉米幼苗生長的影響Fig. 3 Effects of graphene on the growth of maize seedlings

表1 石墨烯懸浮液釋放的離子Table 1 Ions released of graphene suspension

注：表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；*代表與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Data are expressed as Mean±SE; significant difference (P<0.05) between graphene treatments and control group is marked with “*”.

圖4 黃瓜根掃描電子顯微鏡(SEM)照片注：(a)對照，根冠；(b)石墨烯處理(1 000 mg·L-1)，根冠；(c)對照，成熟區(qū)；(d)石墨烯處理(1 000 mg·L-1)，成熟區(qū)。Fig. 4 Scanning Electron Microscope (SEM) images of cucumber rootsNote: (a) CK, root cap; (b) graphene treatment (1 000 mg·L-1), root cap; (c) CK, maturation zone; (d) graphene treatment (1 000 mg·L-1), maturation zone.

圖5 玉米根SEM照片注：(a)對照，根冠；(b)石墨烯處理(1 000 mg·L-1)，根冠；(c)對照，成熟區(qū)；(d)石墨烯處理(1 000 mg·L-1)，成熟區(qū)。Fig. 5 SEM images of maize rootsNote: (a) CK, root cap; (b) graphene treatment (1 000 mg·L-1), root cap; (c) CK, maturation zone; (d) graphene treatment (1 000 mg·L-1), maturation zone.

2.4 氧化損傷

通過對植物體內(nèi)的ROS進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，石墨烯導(dǎo)致黃瓜體內(nèi)ROS含量增加了50%(圖6(a))，而玉米體內(nèi)ROS含量無顯著變化(圖6(a))。這說明，石墨烯對黃瓜幼苗產(chǎn)生了氧化脅迫，對玉米幼苗沒有產(chǎn)生氧化脅迫。脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA會損害細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，是檢測氧化損傷程度的重要指標(biāo)[13]。進(jìn)一步分析MDA的含量，發(fā)現(xiàn)1 000 mg·L-1石墨烯處理過的黃瓜體內(nèi)MDA含量與對照組相比顯著升高(34%)，而石墨烯處理過的玉米幼苗體內(nèi)MDA的含量無顯著性變化(圖6(b))。

2.5 營養(yǎng)吸附

通過吸附實驗，發(fā)現(xiàn)石墨烯主要吸附了雙子葉營養(yǎng)液中的N元素(主要以硝酸根的形式)和Cu離子(表2)，1 000 mg·L-1石墨烯吸附后，營養(yǎng)液中的這2種元素分別減少了84%和30%；對于單子葉營養(yǎng)液，石墨烯主要吸附了其中的N元素(表2)，導(dǎo)致營養(yǎng)液中N元素減少了85%。同時，由于石墨烯材料中含有雜質(zhì)，會釋放Mn離子和P離子[14]，從而導(dǎo)致營養(yǎng)液中的Mn和P離子含量的升高。

圖6 石墨烯對植物體內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量的影響注：*代表顯著性差異(P<0.05)。Fig. 6 Effects of graphene on reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) content in plantsNote: Significant difference was marked with * (P<0.05).

表2 石墨烯吸附后營養(yǎng)液中離子的含量變化Table 2 Changes of ion content in nutrient solution after graphene adsorption

注：表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；*代表與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。

Note: Data are expressed as Mean±SE; significant difference (P<0.05) between graphene treatments and control group is marked with “*”.

利用石墨烯吸附后的1/4營養(yǎng)液上清液培養(yǎng)植物15 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃瓜和玉米幼苗生長都受到了不同程度的抑制。與對照組相比，當(dāng)石墨烯濃度達(dá)到50 mg·L-1時，黃瓜幼苗的生物量(根/地上部鮮重和干重)、根部形態(tài)參數(shù)(根長和根尖數(shù))和株高都受到了明顯的抑制(表3)。玉米除了地上部鮮重和根尖數(shù)，其他的生長指標(biāo)也都明顯減弱(表4)這說明，石墨烯對營養(yǎng)液中的大量元素(N)和微量元素(Cu)的吸附，導(dǎo)致黃瓜和玉米幼苗生長缺乏營養(yǎng)、生長受抑制。營養(yǎng)耗竭是石墨烯對黃瓜和玉米幼苗產(chǎn)生毒性效應(yīng)的重要機理之一。

3 討論(Discussion)

隨著石墨烯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，石墨烯材料不可避免地進(jìn)入到環(huán)境中，在遷移、轉(zhuǎn)化的過程中會對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在的危害。本研究中，石墨烯對植物幼苗的毒性具有時間和濃度效應(yīng)，即隨著石墨烯暴露濃度和時間的增加，毒性效應(yīng)增強。這與人工納米顆粒對植物的毒性效應(yīng)研究結(jié)果一致[15]。同時，石墨烯對黃瓜幼苗的抑制程度要高于其對玉米幼苗的抑制。單子葉植物和雙子葉植物木質(zhì)部結(jié)構(gòu)的不同是產(chǎn)生差異的一個關(guān)鍵因素，單子葉植物只有初生木質(zhì)部，中央有髓，起貯藏作用；不具有形成層，從而不能產(chǎn)生次生結(jié)構(gòu)。雙子葉植物初生木質(zhì)部缺少髓；形成層會不斷地形成次生木質(zhì)部，對水分的輸送要求也較高。這種木質(zhì)部結(jié)構(gòu)的不同對納米顆粒就可能表現(xiàn)出不同的吸收動力學(xué)[10]。也有研究認(rèn)為，納米顆粒對雙子葉植物和單子葉植物的抑制效應(yīng)不同是它們根系構(gòu)型的差異引起的，但這并不是一個共性的結(jié)論[16]。

表3 石墨烯吸附后的營養(yǎng)液對黃瓜幼苗各生長指標(biāo)的影響Table 3 Effects of nutrient solution after graphene adsorption on growth of cucumber seedlings

注：字母代表顯著性差異(P<0.05)。

Note: Significant differences are marked with different letters (P<0.05).

表4 石墨烯吸附后的營養(yǎng)液對玉米幼苗各生長指標(biāo)的影響Table 4 Effects of nutrient solution after graphene adsorption on growth of maize seedlings

注：字母代表顯著性差異(P<0.05)。

Note: Significant differences are marked with different letters (P<0.05).

石墨烯鋒利的邊緣，會對植物根部產(chǎn)生物理的切割損傷，同時導(dǎo)致受試生物體內(nèi)的氧自由基的累積而產(chǎn)生氧化脅迫，這已經(jīng)成為了石墨烯致毒的最為普遍的機理。Begum等[10]的研究表明，石墨烯本身的疏水性質(zhì)導(dǎo)致其分散性較差，易在水體環(huán)境中發(fā)生團聚，與植物根系發(fā)生異相團聚從而在甘藍(lán)、番茄和紅莧菜根系表面聚集而導(dǎo)致物理損傷；同時，植物葉片中的ROS和H2O2含量顯著升高，從而對植物的生長產(chǎn)生抑制效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯對黃瓜和玉米的根部都造成了切割損傷，黃瓜幼苗的ROS和MDA含量都明顯升高，而玉米幼苗的ROS和MDA含量無顯著性變化。

已有研究表明，石墨烯能夠吸附鋅、銅等離子[17]，對硝酸根的吸附量為202 mg·g-1[18]。Zhao等[17]和Ganesan等[18]研究認(rèn)為，石墨烯吸附陰離子的主要機理有2個方面，第一是離子交換，如石墨烯對氟離子的吸附就是通過氟離子和石墨烯上的羥基離子交換；第二是形成強的陰離子—π鍵，吸附能隨其電負(fù)性的增大而降低。Zhao等[19]的研究指出，石墨烯吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)元素，造成營養(yǎng)耗竭，是造成蛋白核小球藻生長毒性的重要機理。本實驗所用的植物營養(yǎng)液中也含有多種離子，而這些離子是黃瓜和玉米幼苗生長所必需的，因此，探究了石墨烯導(dǎo)致的營養(yǎng)耗竭對植物生長的影響，實驗結(jié)果表明，石墨烯對培養(yǎng)液中的營養(yǎng)元素氮和銅的吸附，會導(dǎo)致培養(yǎng)液中營養(yǎng)失衡，從而影響幼苗的正常生長而產(chǎn)生毒性效應(yīng)。本文系統(tǒng)研究了石墨烯對黃瓜和玉米的毒性效應(yīng)，并分析了其致毒機理。進(jìn)一步的研究需要探討石墨烯對黃瓜和玉米幼苗致毒機理不同的原因。