張愛娣, 鄭仰雄, 吳碧珊, 黃東兵

(廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院, 廣州 510520)

生態(tài)系統(tǒng)能夠維持一個完整的鏈條，需要各種的物質(zhì)資源，由此帶來了一系列的物種循環(huán)與能量流動。土壤質(zhì)量反映了陸地生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況，土壤中的微生物和養(yǎng)分含量，都能通過一定的聚集和分級作用，作用于土壤質(zhì)量。其中，土壤微生物的作用較大，能夠加速分解有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)形成土壤腐殖質(zhì)，豐富土壤養(yǎng)分和促進(jìn)其循環(huán)等，使土壤在環(huán)境監(jiān)測、土壤肥力、土地利用等方面的指標(biāo)得以提升，維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的生物化學(xué)特征[1-6]；與此同時，土壤微生物能夠?qū)ν寥鲤B(yǎng)分進(jìn)行分解和轉(zhuǎn)化，使土壤維持能量流動和物質(zhì)循環(huán)，提高質(zhì)量和健康狀況。再以往的研究中，困于微生物學(xué)的技術(shù)和方法，學(xué)界大多從微生物數(shù)量方面研究土壤，通過研究微生物的多樣性，明確土壤微生物在組成和區(qū)系上的變化[7-8]。而隨著一系列生物和化學(xué)測試技術(shù)的進(jìn)步，土壤微生物的多樣性被人們越來越深入地認(rèn)識到，一般使用磷脂脂肪酸(PLFA)分析法、碳素利用法和核酸分析法，從功能、物種和遺傳多樣性等角度展開研究。其中，碳素利用法主要通過Biolog微平板進(jìn)行，由于其在微生物群落變化時表現(xiàn)比較明顯，所以通過探查Biolog代謝多樣性，理清其類型和群落結(jié)構(gòu)而達(dá)成目標(biāo)。所以通過該技術(shù)，能夠研究和發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落的代謝和其功能的多樣性。

珠江三角洲濕地在形成過程中，受到河口周邊地質(zhì)構(gòu)造、地形地貌、河口水動力過程、海平面變化等外在因素的印象，在珠江與海洋的交匯之地形成的，是珠江入海口與海洋相互作用的產(chǎn)物，并形成了獨(dú)特的河口三角洲地貌格局[9-15]。在長期的發(fā)展演變過程中，海平面的上升導(dǎo)致隨珠江入海的泥沙在河口灣大量沉積，促進(jìn)了珠江三角洲的形成，主要表現(xiàn)為，在河口處堆積形成了大量淺灘和濱海濕地，大量細(xì)顆粒沉積物向河口灣外集中并形成了大面積的水下三角洲及粵西陸架泥質(zhì)沉積體[16-17]。但是，從20世紀(jì)80年代以后，由于經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，引發(fā)了珠江三角洲地區(qū)自然生態(tài)環(huán)境的變化，濕地面積逐漸縮小，濱海濕地退化嚴(yán)重，眾多濕地景觀被破壞，該地區(qū)的環(huán)境質(zhì)量急劇下降，生物的多樣性也逐步喪失，這給珠江三角洲地區(qū)帶來了巨大的環(huán)境壓力，也使該地區(qū)的環(huán)境保護(hù)與適度開發(fā)利用呈現(xiàn)不平衡的狀態(tài)[18]。在這種情況下，研究濕地土壤微生物多樣性顯得十分必要。因此，本研究主要集中在對濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落多樣性及其影響因素等方面的探究，為我國的濕地環(huán)境綜合治理與保護(hù)提供必要的借鑒和參考價值。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)分布

研究區(qū)選擇珠江三角洲的淇澳島，面積約為24 km2，由于地處珠江河口內(nèi)西岸橫門河口，所以盛行南亞熱帶海洋性氣候。經(jīng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，該地區(qū)1月平均氣溫為15.3℃，歷年極端最低溫為2.4℃，常年平均氣溫為22.4℃；該地區(qū)的潮汐則呈現(xiàn)不正規(guī)半日潮的特征，主要表現(xiàn)在，漲落潮歷時不等，相鄰的兩個高潮或低潮的潮高不等，平均潮差隨洪季、枯季及大、小潮而不同，一般為0.7～1.9 m；另據(jù)數(shù)據(jù)調(diào)查和分析發(fā)現(xiàn)，影響廣東的熱帶氣旋每年平均多達(dá)12次，其中，有50%的熱帶氣旋顯示在廣東登陸，而有21%的熱帶氣旋顯示在珠江口登陸。

1.2 樣品采集

選擇了淇澳島上的蘆葦濕地、紅樹林濕地、互花米草濕地和堿蓬濕地，并在每個濕地選擇3個重復(fù)樣地，在2015年8月—2018年8月期間，在每個樣地選擇5個20 m ×20 m代表方，用于采集土壤樣品，同時，使用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法獲得0—20 cm土層，并將5個采集點(diǎn)的土壤混合形成土樣，再用四分法將定量的土壤置于封口袋中，放入冰盒帶回實驗室。帶回實驗室的土樣分為兩部分使用，風(fēng)干、磨細(xì)一部分土樣，過100目篩用于測定土壤理化性質(zhì)；置于4 ℃溫度中保存另一部分土樣，以作為分析土壤微生物群落功能多樣性之用。

1.3 土壤微生物群落功能多樣性

土壤微生物能夠使土壤保持活性和肥力，可以從McIntosh，Shannon和Simpson指數(shù)等角度進(jìn)行多樣性測定；而在測定Simpson指數(shù)時，務(wù)必要放大數(shù)據(jù)至一千倍，避免出現(xiàn)負(fù)數(shù)；在分析多樣性時，首先要確認(rèn)無菌的環(huán)境，稱取等同于烘干狀態(tài)下10 kg重量的土壤，加入90 ml NaCl溶液，使其濃度達(dá)到0.145 mol/L，繼續(xù)振蕩半小時，將樣品稀釋至1 000倍，繼而使用BIOLOG排槍從土壤溶液中取出100 μl，用ECO板進(jìn)行接種后再進(jìn)行初次讀數(shù)，再將其放在25℃環(huán)境中培養(yǎng)216 h，注意每間隔12 h進(jìn)行一次讀數(shù)；然后使用0.85%NaCl無菌溶液稀釋樣品，并將其放置在25℃下的Biolog-Eco板進(jìn)行培養(yǎng)，注意在此過程中要媒體都讀取吸光值[19]。

由于Biolog-Eco板中的碳源種類繁多，大約有31種，為準(zhǔn)確探究微生物的利用水平，本研究采取了平均顏色變化率(AWCD)的研究方式。研究表明，當(dāng)土壤微生物對碳源的利用水平越高時，AWCD值越大，并且具有剛大的豐度，該值的計算公式如下[20]：

AWCD=Σ[(Ci-R)/31]

式中：Ci代表第i孔的吸光值；R表示對照孔則；若(Ci-R)<0，則計算過程中將之記為0，即(Ci-R)≥0。

土壤微生物對土壤肥力的保持具有重要的推動作用，其群落功能多樣性的測量，一般通過3個指數(shù)測定實現(xiàn)：McIntosh指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和Simpson指數(shù)[18-19]。

H=-∑Pi(lnPi)

式中：H表示物種豐富度指數(shù)；Pi表示微平板相對吸光值，計算公式為:

Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)

S=被利用碳源的總數(shù)(當(dāng)吸光值≥0.25的情況下微孔總和)

Ds=1-∑Pi

式中：S表示碳源利用豐富度指數(shù)；Ds表示優(yōu)勢度指數(shù)。

想要得到相應(yīng)的光密度值，需要培養(yǎng)96 h才能實現(xiàn)，然后用主成分法對其進(jìn)行分析，在本試驗中，共提取了2個主因子，再繼續(xù)分析微生物對碳源的利用水平。

統(tǒng)計分析：Excel 2007和SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和顯著性水平檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 濱海濕地不同植物群落土壤養(yǎng)分

濱海濕地不同植物群落土壤pH變化范圍在7.13～7.56，基本表現(xiàn)為：互花米草濕地>堿蓬灘濕地>蘆葦濕地>紅樹林濕地，其中不同濕地植物群落土壤pH值差異均不顯著(p>0.05)；土壤有機(jī)碳變化范圍在9.63～13.98 g/kg，基本表現(xiàn)為：互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，其中蘆葦濕地和紅樹林濕地差異不顯著(p>0.05)，二者顯著高于互花米草濕地和堿蓬灘濕地(p<0.05)；土壤全氮變化范圍在0.91～1.18 g/kg，基本表現(xiàn)為：互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，其中不同濕地差異均顯著(p<0.05)；土壤全氮變化范圍在26.52～43.09 g/kg，基本表現(xiàn)為：互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，紅樹林濕地顯著高于其他濕地(p<0.05)(圖1)。

2.2 濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落代謝平均顏色變化率

微生物群落功能多樣性不僅與土壤微生物群落的生態(tài)功能具有較強(qiáng)的相關(guān)性，更能體現(xiàn)土壤微生物群落的生態(tài)功能，作為反映土壤微生物群落利用碳源能力的重要指標(biāo)，平均顏色變化率(AWCD)在一定程度上體反映土壤微生物的代謝活性。在濱海濕地，培養(yǎng)不同的植物群落土壤時，要注意每隔24 h測定AWCD值，就能得到AWCD隨時間的動態(tài)變化圖(圖2)。觀察動態(tài)變化圖能夠發(fā)現(xiàn)，濱海濕地不同植物群落土壤微生物碳源利用與培養(yǎng)時間呈正比例發(fā)展關(guān)系，會隨著培養(yǎng)之間的增加而增加。在開始培養(yǎng)的24 h內(nèi)，AWCD變化不甚明顯；但在培養(yǎng)的24～72 h內(nèi)，堿蓬灘濕地、互花米草濕地、紅樹林濕地和蘆葦濕地中的土壤微生物碳源利用AWCD快速增長，說明微生物在這個階段活性較強(qiáng)；培養(yǎng)時間達(dá)到72 h后，AWCD增長速度減慢；而在192 h后，又開始急劇增長。具體來說，培養(yǎng)時間在48 h之內(nèi)時，濱海濕地中不同植物群落土壤微生物碳源利用基本保持一致的態(tài)勢；而培養(yǎng)時間超出48 h之后，在某時間段內(nèi)，土壤微生物碳源利用的情況為紅樹林濕地>蘆葦濕地>堿蓬灘濕地>互花米草濕地，只是在局部有所波動。

2.3 濱海濕地不同植物群落土壤微生物對碳源利用強(qiáng)度

土壤群落總體的改變，是由土壤微生物的多樣性而引起的，但是通過該信息無法得知微生物群落代謝的情況，但是了解微生物對碳源的利用情況，能發(fā)現(xiàn)一些端倪。研究土壤微生物群落代謝的多樣性，可使用光密度增加較快的120 h的AWCD值進(jìn)行分析。從化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)出發(fā)，將ECO板上的31種碳源分成氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、聚合物、胺類、酚酸類等6類。如果對碳源進(jìn)行培養(yǎng)，時間越久，微生物對其的利用數(shù)量也會越來越多。

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

圖1 濱海濕地不同植物群落土壤養(yǎng)分

圖2 濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落代謝平均顏色變化率

由表1可知，對于碳源的利用，不同的微生物之間的區(qū)別一般比較大。以濱海濕地為主要考察地域來看，不同植物群落土壤微生物對碳源的利用率也大不相同。通過試驗發(fā)現(xiàn)，紅樹林濕地中的土壤生物對碳源的利用率最高，互花米草濕地中的土壤生物對碳源的利用率最低，蘆葦濕地和堿蓬灘濕地居中，且蘆葦濕地中的土壤生物對碳源的利用率小于紅樹林濕地大于堿蓬灘濕地。其中，對碳水化合物類的利用比率變化范圍為0.79～1.46，利用羧酸類的比率變化范圍為1.02～1.51，利用聚合物類的比率變化范圍為0.65～0.99，利用胺類率變化范圍為0.17～0.37，對酚酸類利用率變化范圍為0.61～0.71。概而言之，濱海濕地不同植物群落土壤微生物的主要碳源，除了碳水化合物、羧酸類碳外，還包括氨基酸類、酚酸類、聚合物類和胺類碳源等種類。

2.4 濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落多樣性

由圖3可知，濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)存在一定差異，土壤微生物物種豐富度指數(shù)(H)變化范圍為1.63～3.35，基本表現(xiàn)為互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，其中不同濕地差異均顯著(p<0.05)；土壤微生物均勻度指數(shù)(E)變化范圍為0.24～0.75，基本表現(xiàn)為互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，其中互花米草濕地和堿蓬灘濕地差異均不顯著(p>0.05)；優(yōu)勢度指數(shù)(Ds)變化范圍變化范圍為0.686～0.701，基本表現(xiàn)為互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，其中不同濕地差異均不顯著(p>0.05)；碳源利用豐富度指數(shù)(S)變化范圍為7.15～16.79，基本表現(xiàn)為互花米草濕地<堿蓬灘濕地<蘆葦濕地<紅樹林濕地，其中不同濕地差異均顯著(p<0.05)。

表1 濱海濕地不同植物群落土壤微生物對碳源利用強(qiáng)度

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖3 濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落多樣性

2.5 土壤微生物群落碳源利用類型的主成分分析

在處理數(shù)據(jù)降維時，可以考慮使用主成分分析法。主成分分析法可以被用作對多個變量進(jìn)行線性變換，并選擇出少個數(shù)重要變量。在分析濱海濕地不同植物群落根區(qū)土壤微生物群落功能的差異時，要從31種碳源的利用情況出發(fā)進(jìn)行分析。明確試驗對象的主成分(PC)分析(PCA)后，選取第120小時時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，明確4個主成分。其中，主成分1，2能分別解釋變量方差的69.286%和84.156%，前3個主成分之和為94.197%，所以，本文主要闡釋前3種成分。對主成分進(jìn)行分析后可知，3個主成分載荷31個碳源，見表2，如果主成分載荷的碳源分子越多，受到的影響就越大。由表3可知，與第一主成分密切相關(guān)的碳源總數(shù)為18種，占據(jù)種類數(shù)量最多的為碳水化合物，達(dá)6種；其次為羧酸類化合物，達(dá)5種；接著是多聚化合物、氨基酸、芳香化合物和胺類化合物，數(shù)量分別為3種、2種、1種和1種。需要注意的是，對主成分分離影響最大的是胺類和氨基酸類碳源。

表2 方差分解主成分提取分析

表3 不同碳源的主成分載荷因子

2.6 土壤養(yǎng)分與微生物多樣性之間相關(guān)性

土壤微生物想要生存和繁殖，必須要依賴土壤中的養(yǎng)分，確切地說，要依賴有機(jī)碳和氮源。所以，土壤養(yǎng)分對微生物群落多樣性具有至關(guān)重要的作用(表4)，土壤微生物群落功能的變化與土壤養(yǎng)分的變化呈正比例關(guān)系。與土壤pH之間的關(guān)系為負(fù)相關(guān)。土壤微生物群落優(yōu)勢度指數(shù)不容易受到土壤養(yǎng)分的影響，這是因為，碳源利用豐富度指數(shù)(S)、均勻度指數(shù)(E)和物種豐富度指數(shù)(H)土壤養(yǎng)分各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)，均高于優(yōu)勢度指數(shù)(Ds)。概而言之，土壤養(yǎng)分、土壤pH和微生物群落功能多樣性之間，是相互依賴和影響的，土壤養(yǎng)分的貢獻(xiàn)程度較高，土壤pH的貢獻(xiàn)程度較低。由以上推斷可知，濱海濕地不同植物群落土壤微生物群落多樣性會存在較大差異。

表4 土壤養(yǎng)分與微生物多樣性之間相關(guān)性

注：*，**分別表示在0.05，0.01水平上差異顯著。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物利用碳源的程度顯示了其活性，這種利用水平為平均顏色變化率(AWCD)，側(cè)面反映了微生物種群數(shù)量及其活動規(guī)律、分布特征等。其中AWCD值越大，說明微生物群的密度較大，具有較強(qiáng)的活性，而如果AWCD值越小，則說明微生物群的密度較小，不具備較強(qiáng)的活性。人們在研究中發(fā)現(xiàn)，在不同的植物群落的土壤中培養(yǎng)微生物，其活性存在較大的差異性，尤其是從Biolog-ECO板中碳源代謝能力角度來講，紅樹林濕地和蘆葦濕地中的微生物代謝能力更為強(qiáng)大，探究其深層次的原因，與碳源物質(zhì)密不可分。在紅樹林濕地和蘆葦濕地中，由于土壤中的養(yǎng)分含量高，那些與碳源物質(zhì)能夠融洽并存的微生物能能夠充分利用板中的碳源，提高碳源代謝能力，產(chǎn)生更多可利用碳源，從而有利于更多的微生物滋生。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)了另一個現(xiàn)象，即微生物活性能夠影響植被屬性，這也收到了以往研究者的證實。紅樹林濕地和蘆葦濕地中存在數(shù)量巨大的根系分泌物或植物殘體，提高了土壤中的有機(jī)質(zhì)含量，能夠給予微生物更多的養(yǎng)分，從而提高其生物，促進(jìn)微生物的生長發(fā)育與滋生，增加了新陳代謝的效率[21-22]。而在堿蓬灘濕地和互花米草濕地中，土壤中的含水量較低，養(yǎng)分不多，僅能滿足植物生長所需，對于微生物獲取養(yǎng)分造成了一定的阻礙，從而使微生物減少了參與有機(jī)質(zhì)分解活動，缺乏代謝活性，影響其生長發(fā)育及繁殖；紅樹林濕地和蘆葦濕地具有天然優(yōu)良的自然環(huán)境，能夠提供充沛的養(yǎng)分，不僅能使植物旺盛生長，也能給微生物創(chuàng)造良好的生長環(huán)境，從而使得濕地中微生物的活性較為顯著。研究人員還發(fā)現(xiàn)，微生物對不同碳源的利用也存在一些差異，對碳源利用水平最低的微生物位于湖濱高灘地，而對碳源利用水平最高的微生物位于沉水區(qū)，總體而言，微生物利用效果較好的碳源為羧酸類、碳水化合物碳源，而利利用效果較差的為胺類碳源。

土壤微生物對不同的碳源利用效果不同，呈現(xiàn)出不同的利用水平，大多是從多樣性指數(shù)和豐富度方面體現(xiàn)的；而Shannon指數(shù)能體現(xiàn)微生物的功能多樣性指數(shù)，即在顏色變化率相同的條件下，土壤微生物利用碳源的種類和數(shù)量，該指數(shù)不僅能反映微生物物種的變化度，還能體現(xiàn)其差異度。當(dāng)微生物利用碳源種類和數(shù)量較少時，該指數(shù)呈現(xiàn)較低的狀態(tài)[23-25]。另外，研究物種時，還要考慮其分布均勻程度，一般采用Mc-Intosh指數(shù)進(jìn)行衡量，即單位面積內(nèi)分布的物種數(shù)量越多，則該指數(shù)越大。而Shannon指數(shù)除了能夠反映微生物群落分布的均勻度，還能反應(yīng)物種數(shù)量。研究人員發(fā)現(xiàn)，微生物群落在紅樹林濕地和蘆葦濕地的Shannon-Wiener指數(shù)較高，說明該區(qū)域的微生物分布比較均勻，且種類繁多，是較為適宜微生物群落生長的區(qū)域。

分析碳源利用的主成分分析發(fā)現(xiàn)，不同的土壤微生物在代謝功能多樣性等方面存在較大差異，而差異表現(xiàn)最明顯的是聚合物類和羧酸類，主要原因在于其成分具有與根系分泌物相似的成分，由此表明，該類分泌物極大地影響了微生物的群落功能[26-28]，主要表現(xiàn)在分泌物不斷積累，不僅會影響植株正常的生長發(fā)育，還會影響微生物的活動。微生物在生長發(fā)育過程中所需要的碳源和氮源，能夠從土壤養(yǎng)分中獲得，本研究所探究和分析的問題是土壤養(yǎng)分與微生物多樣性之間存在的關(guān)系(表4)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，微生物所需的養(yǎng)分主要來源自土壤養(yǎng)分，其多樣性受到土壤養(yǎng)分的影響為正向的，而受到土壤pH的影響為負(fù)向的，土壤有效養(yǎng)分與微生物多樣性呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。整體而言，土壤養(yǎng)分和土壤pH是微生物多樣性的顯著指標(biāo)之一，影響了微生物群落的分布；微生物群落分布還受到植物種類、土壤屬性和植被覆蓋度等因素的影響，對這些因素的研究有助于土壤肥力的保持。