曾建亮，鄧全恩，李建安，程軍勇，鄧先珍，姜德志

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)局重點(diǎn)實驗室；b.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實驗室；c.經(jīng)濟(jì)林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心；d.南方丘陵山地生態(tài)經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004；2.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，湖北 武漢 430075）

植物在長期的進(jìn)化過程中，為適應(yīng)外界環(huán)境往往會改變自身結(jié)構(gòu)，形成了一系列特定的外部形態(tài)特征，并影響其子代的生長、發(fā)育和生理特征。葉片是植物進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官，易受環(huán)境變化的影響，其形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)特征不但與葉片的生理功能密切相關(guān)，而且反映了樹木對環(huán)境變化的響應(yīng)和適應(yīng)情況[4-5]。滕堯等[6]在對西番蓮低溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，耐寒性較強(qiáng)的品種其葉片的柵海比高、組織結(jié)構(gòu)緊密度大，溫度下降時這一特點(diǎn)更加明顯。郭學(xué)民等[7]在研究桃葉片解剖結(jié)構(gòu)與樹干耐寒性的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，葉片厚度、單位面積氣孔總周長、柵海比和主脈木質(zhì)部面積都是影響其耐寒性的主要葉指標(biāo)，他們據(jù)此評價桃樹耐寒性的結(jié)果與大田調(diào)查結(jié)果一致。大量研究結(jié)果都表明，在植物的耐寒性研究中，葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)特征可被作為一個重要評價指標(biāo)，在不同品種間雖然主要評價指標(biāo)有所差異，但研究者普遍認(rèn)為，葉片結(jié)構(gòu)越緊密則其耐寒性越好，反之越差[8-11]。為給油茶引種提供參考依據(jù)，本研究選取湖北省林業(yè)科學(xué)研究院武漢市九峰苗木基地上不同的油茶種質(zhì)資源，對其葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀測，初步評價了不同品種油茶的耐寒性，現(xiàn)將研究結(jié)果分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗地概括

試驗地為湖北省林業(yè)科學(xué)研究院試驗林場武漢市九峰苗木基地。該地屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候區(qū)，年降水量達(dá)1 100 mm；每年7—8月氣溫最高，1月氣溫最低，1月平均氣溫0.4 ℃，極端最低氣溫可至-18.1 ℃。

1.2 試驗材料

供試的油茶品種分別為岑軟3號、鄂油54號、贛州油8號、長林4號、鄂油102號、大別山1號，其樹齡為6～8 a，其長勢均良好，栽培環(huán)境條件和管理措施基本一致。于2018年1月采取不同品種油茶樹同一部位的新鮮成熟葉片，在葉片中部取約1 cm2的小片，立即放入FAA溶液中保存以備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)的觀察

采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)制作葉片樣本，用顯微鏡觀察、拍照。每張切片各觀察3個視野，利用Photoshop CS 6.0軟件測定葉片厚度（leaf thickness）、上表皮厚度（thickness of upper epidermis）、柵欄組織厚度（thickness of palisade tissue）、海綿組織厚度（thickness of spongy tissue）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis），計算柵海比（palisade tissue-spongy tissue ratio）、組織結(jié)構(gòu)緊密度（tightness of tissue structure）和組織結(jié)構(gòu)疏松度（looseness of tissue structure）及變異系數(shù)（coefficient of variation,CV），計算公式分別如下：

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；

組織結(jié)構(gòu)緊密度=柵欄組織厚度/葉片厚度；

盡管他們的作品稚嫩，但我還是給予最大的支持和鼓勵。有東西可寫，又有了精神支持者，他們就不會太受拘束，放開手腳地去寫。現(xiàn)在有好幾個同學(xué)積極地去投稿，有的同學(xué)還自己給自己的作品找了家——自己出寫作小集子。我為他們加油，自己也努力去做他們創(chuàng)作路上的導(dǎo)航人。

組織結(jié)構(gòu)疏松度=海綿組織厚度/葉片厚度；

變異系數(shù)=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100。

1.3.2 氣孔的觀察

采用指甲油印跡法制片，在顯微鏡及其成像系統(tǒng)下觀察、拍照。利用Photoshop CS 6.0軟件測定氣孔密度（stoma density），然后計算變異系數(shù)（CV）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

采用隸屬函數(shù)法評價不同品種油茶的耐寒性。若該指標(biāo)與耐寒性呈正相關(guān)，則計算公式為式（1），若該指標(biāo)與其耐寒性呈負(fù)相關(guān)，則計算公式為（2）。

式（1）和（2）中：U(Xi)為耐寒隸屬函數(shù)值；i為某項指標(biāo)，Xi為某項指標(biāo)的測定值；Xmin和Xmax分別為某項指標(biāo)測定值的最小值和最大值。根據(jù)篩選的典型指標(biāo)計算各油茶品種的平均隸屬度，數(shù)值越大則表明其耐寒性越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片結(jié)構(gòu)特征比較

2.1.1 葉片厚度比較

植物葉片厚度受氣溫、空氣濕度及光照強(qiáng)度等因素的影響，在濕冷環(huán)境下葉片較厚，其含水量則高，而寒冷環(huán)境可延緩葉片遭受低溫的損害。6個油茶品種葉片組織結(jié)構(gòu)的觀測結(jié)果見表1。由表1可知，6個油茶品種葉片厚度為346.84～404.17 μm，且其差異顯著，其中，鄂油54號的葉片最厚，而岑軟3號的葉片最薄。

表1 6個油茶品種葉片組織結(jié)構(gòu)的觀測結(jié)果?Table 1 Observation results of tissue structures in leaves of six C.oleifera cultivars

2.1.2 葉片表皮特征比較

油茶葉片為異面葉，上表皮和下表皮均為單層排列緊密的不規(guī)則長方形細(xì)胞，且上表皮厚度均大于下表皮厚度，其厚度差異顯著。6個油茶品種的上表皮厚度為18.80～26.29 μm，下表皮厚度為15.20～21.18 μm，大別山1號的上表皮和下表皮厚度均大于其他品種的表皮厚度，而岑軟3號和鄂油54號的上表皮和下表皮厚度均較薄。

油茶氣孔主要分布在下表皮，6個油茶品種葉片的橫切面和下表皮的氣孔顯微結(jié)構(gòu)分別如圖1和2所示。由圖1可知，油茶葉片的氣孔為橢圓形或長圓形，6個油茶品種葉片下表皮的氣孔密度為172.92～266.67 個·mm-2，其差異極顯著，贛州油8號的氣孔密度最大，岑軟3號的氣孔密度最小。氣孔與植物水分及氣體交換均密切相關(guān)，從而影響油茶葉片的耐寒性。

圖1 6個品種油茶葉片的橫切面Fig.1 Leaf cross sections of six C.oleifera cultivars

圖2 6個油茶品種葉片下表皮的氣孔顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 Microscopic structures of stomata in leaf lower epidermis of six C.oleifera cultivars

2.1.3 葉肉組織結(jié)構(gòu)特征

從圖1中可以觀察到，岑軟3號的葉肉結(jié)構(gòu)明顯不同于其他油茶品種，只有兩層?xùn)艡趯?，柵欄組織細(xì)胞為較細(xì)長的長柱形，排列緊密；而其他油茶品種均有三層?xùn)艡趯蛹?xì)胞，其與海綿組織相鄰的柵欄組織層的排列均較疏松。鄂油54號的柵欄層細(xì)胞呈較粗短的圓柱形，其排列較緊密；贛州油8號的柵欄層細(xì)胞為較粗短的圓柱形，排列緊密；長林4號的柵欄層細(xì)胞為較細(xì)的長柱形，排列緊密；鄂油102號的柵欄層細(xì)胞為較粗短的圓柱形，排列緊密；大別山1號的柵欄層細(xì)胞呈呈較細(xì)的長柱形，排列緊密。一般而言，從圖1中也可看出，細(xì)長類的柵欄層細(xì)胞較粗短型的排列更整齊緊密。柵欄層細(xì)胞排列越緊密，表明其耐寒性越強(qiáng)。

由表1可知，6個油茶品種間葉片組織結(jié)構(gòu)的差異明顯，其柵欄組織厚度為129.77～171.10 μm，海綿組織厚度為164.15～208.65 μm，柵海比為 0.71～0.95，細(xì)胞組織緊密度為37.41～43.06，細(xì)胞組織疏松度為45.12～52.41。綜合比較后發(fā)現(xiàn)，6個油茶品種中，大別山1號的柵欄組織層厚度、柵海比及細(xì)胞組織緊密度數(shù)值均為最大值，表明大別山1號的葉片結(jié)構(gòu)較其他品種更為緊密；而鄂油54號和岑軟3號的海綿組織厚度與細(xì)胞組織疏松度數(shù)值均較大，表明這兩個品種的葉片結(jié)構(gòu)均較疏松。

2.2 不同品種油茶耐寒性的綜合評價

為了確立最佳評價方案，對6個油茶品種葉片的9項解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，9項葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)可聚集為4類：第1類包括葉片厚度、柵欄組織厚 度、組織結(jié)構(gòu)緊密度、下表皮厚度；第2類包括上表皮厚度、柵海比；第3類包括組織結(jié)構(gòu)疏松度、海綿組織厚度；第4類包括氣孔密度。此時各類別指標(biāo)間有較為明顯的距離，其相關(guān)性較小。根據(jù)相關(guān)指數(shù)的大小確定各類指標(biāo)中的典型指標(biāo)，相關(guān)指數(shù)的計算公式為：Ri2=Σr2/(n-1)。式中：Ri2為每類別指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)；i為某類指標(biāo)，i=1,2,…n，n為每類指標(biāo)的個數(shù)；r為同類指標(biāo)中各相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)。葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)矩陣見表2，指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)反映了各指標(biāo)間的相互影響關(guān)系。在同一類別指標(biāo)中，相關(guān)指數(shù)最大的指標(biāo)即為該類指標(biāo)中的典型指標(biāo)，若相關(guān)指數(shù)相等，同類指標(biāo)中各指標(biāo)變異系數(shù)的大小即可反映該指標(biāo)的差異性，因而選取變異系數(shù)最大的指標(biāo)作為典型指標(biāo)。根據(jù)相關(guān)系數(shù)計算出的4個類別指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)，然后根據(jù)相關(guān)指數(shù)大小對其進(jìn)行排序，結(jié)果見表3。由表3可知，4類指標(biāo)中的典型指標(biāo)分別為：第1類為組織結(jié)構(gòu)緊密度；第2類為上表皮厚度；第3為海綿組織厚度；第4類為氣孔密度。

圖3 9項葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的聚類分析結(jié)果Fig.3 Cluster analysis result of nine leaf anatomic structure indexes

根據(jù)篩選出的與各個油茶品種耐寒性密切相關(guān)的4項葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)（上表皮厚度、海綿組織厚度、組織結(jié)構(gòu)緊密度、氣孔密度），應(yīng)用隸屬函數(shù)法對6個油茶品種的耐寒性進(jìn)行綜合評價，結(jié)果見表4。由表4可知，6個油茶品種的耐寒性由強(qiáng)到弱依次為：大別山1號＞鄂油102號＞贛州油8號＞長林4號＞岑軟3號＞鄂油54號。

表2 葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)矩陣?Table 2 Correlative matrix of leaf anatomic structure indexes

表3 4類葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)指數(shù)及排序Table 3 Correlation indexes and ranking of four categories of leaf structure indexes

表4 6個油茶品種耐寒性的綜合評價結(jié)果Table 4 Comprehensive evaluation result of cold tolerance in six C.oleifera cultivars

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

3.1.1 表皮結(jié)構(gòu)特征與油茶耐寒性的關(guān)系

表皮是植物的保護(hù)組織，是植物抵御外界不良環(huán)境的屏障，葉片表皮厚可以減輕低溫等對葉片內(nèi)部組織的傷害[12-13]。氣孔是葉片內(nèi)部組織與外界環(huán)境之間進(jìn)行氣體交換及植物水分散失的主要通道，氣孔數(shù)量多，呼吸效率高，生長速率快，水分散失量也大[14]，因此，一般認(rèn)為，葉片氣孔密度小的植物其耐寒性強(qiáng)[15-17]。本研究結(jié)果表明，不同品種油茶的耐寒性與其上表皮厚度的大小順序較為一致，而與其氣孔密度的排序差異較大。這一研究結(jié)果說明，在評價油茶耐寒性時，不能以單項指標(biāo)作為評價標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.2 葉肉結(jié)構(gòu)特征與油茶耐寒性的關(guān)系

有關(guān)研究結(jié)果表明，植物葉片結(jié)構(gòu)可以反映植物的耐寒性，柵欄組織排列緊密且厚度越大則其耐寒性越好，而海綿組織排列疏松且厚度越大則不利于植物耐寒[18-19]。環(huán)境變化可導(dǎo)致葉片組織結(jié)構(gòu)的改變，且不僅僅是單一結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因而也要綜合比較葉片組織結(jié)構(gòu)間存在相互制約關(guān)系的結(jié)構(gòu)指標(biāo)（緊密度、疏松度、柵海比）。也有研究結(jié)果表明，植物的耐寒性與葉片結(jié)構(gòu)緊密度和柵海比均呈正相關(guān)，而與結(jié)構(gòu)疏松度呈負(fù)相關(guān)[21-24]。研究中發(fā)現(xiàn)，在6個油茶品種葉片的解剖結(jié)構(gòu)中，大別山1號的組織結(jié)構(gòu)緊密度最大，這與其耐寒性評價結(jié)果的最大值一致；鄂油54號的海綿組織最厚，這與其耐寒性評價結(jié)果的最小值一致；而其他油茶品種組織結(jié)構(gòu)緊密度的排序及其海綿組織厚度的排序與其耐寒性的排序均有差異，說明在評價油茶耐寒性時不能僅僅以組織結(jié)構(gòu)緊密度或海綿組織厚度此類指標(biāo)中的某一單項指標(biāo)作為評價標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)當(dāng)考慮多項指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。

3.2 討 論

本研究應(yīng)用變異系數(shù)分析了各個油茶樹種葉片各項結(jié)構(gòu)指標(biāo)的穩(wěn)定性，并用相關(guān)分析法和聚類分析法對葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行了歸類篩選，再用篩選出的典型指標(biāo)對6個油茶品種的耐寒性進(jìn)行了初步評價。結(jié)果表明，耐寒性是葉片多項結(jié)構(gòu)指標(biāo)相互作用的結(jié)果，若單獨(dú)以某項指標(biāo)來分析，不同油茶品種的耐寒性的排序則各有不同，因此，必須采用多項結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行綜合比較和分析。本研究采用隸屬函數(shù)法對6個油茶品種的耐寒性進(jìn)行了綜合評價，結(jié)果顯示，大別山1號的耐寒性最強(qiáng)，其次依次是鄂油102號、贛州油8號、長林4號和岑軟3號，鄂油54號的耐寒性最弱。油茶耐寒性不僅受其遺傳、自身結(jié)構(gòu)的影響，同時與外界環(huán)境相關(guān)。鄂州油茶品種系列的耐寒性，其種間差異的存在引起其耐寒性差異的出現(xiàn)，后續(xù)研究應(yīng)從分子水平上進(jìn)一步探索油茶抗寒機(jī)理。此外，有關(guān)研究結(jié)果表明，同一座山上不同生態(tài)區(qū)域間海拔越高、溫度越低的野生油茶品種其抗寒性越強(qiáng)[25]，而且，將來自不同地區(qū)的油茶品種引種栽培到氣候相近的地方后其耐寒性的表現(xiàn)也不同，說明其耐寒性仍受種源地的影響[26]。本研究僅從不同油茶品種葉片結(jié)構(gòu)方面分析其耐寒性，沒有與油茶生長相關(guān)的其他生理指標(biāo)結(jié)合起來分析，因而存在一定的局限性。后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步調(diào)查統(tǒng)計低溫時期油茶的生長狀況，并結(jié)合油茶的生理反應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行測定分析，采集連續(xù)多年的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行油茶耐寒性評價，以得到更加準(zhǔn)確的評價結(jié)果。