張 繼，黃國弟，張 宇，歐克緯，龍凌云，龐新華，盧業(yè)飛

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 廣西亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001）

選育矮化品種和矮化砧木是實現(xiàn)杧果以及其他多年生喬化果樹產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展的重要途徑之一[1-2]。以往對矮化機理的研究多集中在輻射誘變、整形修剪[3]、生理生化指標(biāo)測定[4-5]等方面，基因調(diào)控赤霉素（GA）合成而影響矮化效應(yīng)方面的研究鮮見報道[6]。矮化特性已成為關(guān)于喬化果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究的熱點。植物中參與赤霉素合成分解的酶較多，GA2ox（赤霉素2β氧化酶）就是其中之一，該酶是一種抑制活性GA合成的酶，可以降低活性GA含量，從而達(dá)到調(diào)節(jié)植物株高的目的[7-8]。GA2ox也是唯一一種降解活性GA的關(guān)鍵酶，GA2ox在GA代謝過程中具有負(fù)調(diào)節(jié)GA合成的作用[6]。GA2ox是使活性GA失活的關(guān)鍵酶，是由多基因編碼的雙加氧酶[9-10]。GA2ox作用于有生物活性的GA1和GA4，將其轉(zhuǎn)變成無活性的GA8和GA34[11]。GA2ox調(diào)節(jié)GA代謝途徑已在擬南芥中得到證實[12]。2004年，課題組自主選育的‘桂熱杧82號’Mangifera indicaL.cv.Guire No.82通過了廣西農(nóng)作物品種登記[13]。該品種又名‘桂七杧’，樹勢中庸，樹姿開張，樹冠卵圓形，具有矮化特性。有關(guān)該品種矮化特性分子層面的研究尚未開展，不確定其是否與GA相關(guān)。目前，關(guān)于杧果GA合成途徑中關(guān)鍵酶基因的功能研究鮮見報道。因此，本項目以‘桂熱杧82號’為供試材料，進行GA2ox基因克隆、亞細(xì)胞定位以及表達(dá)分析，將該基因命名為MiGA2ox，探討MiGA2ox基因調(diào)控赤霉素合成與植株矮化的關(guān)系，旨在為研究杧果樹體發(fā)育過程中GA合成調(diào)控以及GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用提供參考，并為矮生型杧果品種及矮化砧木的選育提供參考[14-18]。

1 材料與方法

2018—2019年，在廣西亞熱帶作物研究所優(yōu)勢作物繁育及綜合開發(fā)新技術(shù)重點實驗室進行試驗。

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料

‘桂熱杧82號’種植于廣西亞熱帶作物研究所杧果種質(zhì)資源圃。采集剛抽生無病蟲害侵染的嫩葉放入裝有液氮的冰壺中，迅速帶回實驗室，置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹19-20]。

1.1.2 耗 材

DNA Marker、T4DNA連接酶、Q5?超保真DNA聚合酶、2×Taq Master Mix、First Choice RLM-RACE Kit、5×RT Reaction Buffer、dNTP、RNaes Inhibitor、M-MLV RTase、凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，接頭和引物由華大基因生物科技（深圳）有限公司合成。

1.1.3 載體及感受態(tài)

克隆載體pGEM-T Vector購于華大基因生物科技（深圳）有限公司；JM109感受態(tài)保存于廣西亞熱帶作物研究所優(yōu)勢作物繁育及綜合開發(fā)新技術(shù)重點實驗室；亞細(xì)胞定位載體pK7FWGF2.0和PEASY-T1由迦康創(chuàng)因生物科技（武漢）有限公司提供。

1.2 方 法

杧果葉片總RNA的提取參考侯哲等的方 法[21]，略有改動。

1.2.1 RNA反轉(zhuǎn)錄

解凍First-Strand cDNA Synthesis Kit試劑，上下輕柔顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。冰上配制RNA-Primer Mix，在預(yù)冷的RNasefree反應(yīng)管內(nèi)加入總RNA 1 μg、250 μmol/L隨機引物1 μg，最后加入DEPC處理水使終體積至 13 μL。RNA變性：混勻RNA-Primer Mix，進行短暫離心，65 ℃變性10 min后立即放于冰上。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：在RNA-Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)，加入RNA-Primer Mix 13 μL、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTP 1 μL、25 U/μL RNaes Inhibitor 1 μL、200 U/μL M-MLV RTase 1 μL，加入DEPC處理水使終體積至25 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：混勻反應(yīng)Mix，短暫離心后37 ℃孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后，85 ℃滅活處理5 min，-20 ℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，待用。

1.2.2 目的片段克隆及回收

根據(jù)GenBank中公布的GA2oxcDNA序列，設(shè)計1對簡并引物，分別是GA2ox-F：AAYGGYGATRTBGGHTGGRTYGAATA；GA2ox-R：TGCYTYACRCTYTTAAAYCTYCCATTWGTCA。參考1.2.1，進行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系為 100 ng/μL模 板cDNA 1 μL、50 mmol/L Primer-F 1 μL、50 mmol/L Primer-R 1 μL、25 mmol/L dNTPs 4 μL，加ddH2O至總反應(yīng)體系50 μL。PCR反應(yīng)程序為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物選擇2.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥漳康钠危B接到pGEM-T Vector載體上，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，取陽性單克隆搖菌并進行測序。

1.2.3 3'末端獲得

將Ramdom 6替換為接頭引物R11466（GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN）進行反轉(zhuǎn)錄，孵育溫度42 ℃，反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)溫度95 ℃。PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.2。以通用引物R16326（GGTGGTAGAGCTCGCAGGA CTGCAGCTGACTG）和特異的外側(cè)引物GA2ox3′ GSP-1（CCGCCATGTCCGGATATTCA）、GA2ox3′ GSP-2（ATCCAACAACACTTCCGGCT）進 行 首輪擴增。PCR擴增體系為100 ng/μL cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上下游引物各2 μL，0.5 μL rTaq酶，用ddH2O補足至40 μL。PCR反應(yīng)程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。以稀釋10倍的第1輪PCR產(chǎn)物為模板，以內(nèi)側(cè)引物R16324（AGAGCTCGCAGG ACTGCAGCAGCTGACTGACTAC）分別與GA2ox3′ GSP-1、GA2ox3′ GSP-2進行第2輪擴增，PCR反應(yīng)體系同第1輪擴增。將PCR產(chǎn)物進行1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳分析，并進行切膠回收目的片段，連接到PEASY-T1載體上轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，鑒定出陽性菌落進行測序。

1.2.4 5′末端獲得

cDNA的獲得同1.2.3。利用GA2ox5′ GSP-1（GCACCTGCATAATCAACCACAA）進行PCR的第1輪擴增。PCR反應(yīng)體系為100 ng/μL cDNA 2 μL，10×PCR Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上下游引物各2 μL，0.5 μL rTaq酶，補充ddH2O使終體積至40 μL。PCR反應(yīng)程序為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 1 min，4 ℃保溫。以稀釋10倍的第1輪PCR產(chǎn)物為模板，利用GA2ox5′ GSP-2（GCTTGGGTACTGGCAAAAGC）進行第2輪擴增，PCR反應(yīng)體系和測序同1.2.4的第1輪擴增。

1.2.5 編碼序列生物信息學(xué)分析

將3′末端、5′末端和中間目的基因片段拼接成完整GA2ox基因序列。利用NCBI提供的Blast程序進行GA2ox基因序列同源搜索以及相似性分析。采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線分析GA2ox編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、理論等電點和穩(wěn)定性[22]；采用Phobius（http://www.phobius.sbc.su.se/）軟件分析GA2ox編碼蛋白質(zhì)的信號肽以及蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；采用DNAMAN軟件預(yù)測GA2ox編碼蛋白質(zhì)的疏水性和二級結(jié)構(gòu)。

1.2.6 實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析

利用Beacon Designer設(shè)計引物，探究MiGA2ox基因在‘桂熱杧82號’和‘金煌杧’隨機不同時期中的表達(dá)情況。以杧果actin內(nèi)參基因設(shè)計actin-F和actin-R引物。根據(jù)已克隆得到的MiGA2ox序列設(shè)計特異引物GA2ox-YGF和GA2ox-YGR。cDNA的獲得同1.2.1。PCR定量反應(yīng)步驟：1）將All-in-OneTMqPCR Mix在室溫下融解，輕柔地上下顛倒混勻并進行短暫離心。2）冰上配制PCR Reaction Mix，包括2×All-in-OneTMqPCR Mix 10 μL、qPCR Primer （1 μmol/L） 2 μL、cDNA Template 2 μL，加入ddH2O使終體積至20 μL。在試驗中設(shè)計了NTC（no template control），其為陰性對照，即用水代替模板cDNA，其他試劑不變，從而確保體系無污染。3）將反應(yīng)管進行短暫離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)管底部。PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進行溶解曲線分析，即溫度控制在72～95 ℃，每間隔10 s升高0.5 ℃，最后25 ℃保持30 s。試驗設(shè)置3次重復(fù)。采用7300 System軟件和2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 亞細(xì)胞定位

取長勢健康的蓮座期擬南芥葉片18張，用剪刀將其裁成0.5 mm寬的細(xì)條，放入10 mL酶解液（1.5% Cellulase R10與0.4% Macerozyme R10）中酶解110 min，將酶解液過濾200目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，100×g離心3 min，留沉淀，沉淀即原生質(zhì)體。取適量洗液（MMG溶液）溶解原生質(zhì)體。在MiGA2ox基因的ORF引入SalI和XbaI酶切位點，提取正確克隆的質(zhì)粒，同pK7FWGF2.0-GFP質(zhì)粒用SalI和XbaI雙酶切，分別回收小片段和大片段，用T4DNA連接酶連接，從而得到pK7FWGF2.0-GFP/GA2ox融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入JM109，PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證。通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiGA2ox基因克隆

以杧果葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第1鏈為模板，用特異性引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，在約900 bp處存在肉眼清晰可見的特異性條帶（圖1）。

圖1 GA2ox基因序列中間片段Fig.1 Intermediate fragments in GA2ox gene sequence

根據(jù)已獲得的GA2ox基因中間片段的序列信息分別設(shè)計2條特異引物（GA2ox3′ GSP-1、GA2ox3′ GSP-2）與通用引物進行PCR擴增，得到約900 bp的DNA片段（圖2）。

圖2 GA2ox基因 3′末端Fig.2 3′ terminal in GA2ox gene

根據(jù)已獲得的GA2ox基因中間片段的序列信息分別設(shè)計2條特異引物（GA2ox5′ GSP-1、GA2ox5′ GSP-2）與通用引物進行PCR擴增，得到約400 bp的DNA片段（圖3）。

圖3 GA2ox基因 5′末端Fig.3 5′ terminal in GA2ox gene

利用DNAMAN軟件對3′末端、5′末端及中間片段進行拼接，得到基因的全長序列。用BLAST進行核苷酸相似性檢索，發(fā)現(xiàn)GA2ox序列與橙子（XM_006467404.3）、柑橘（XM_006449629.2）、木薯（XM_021738345.1）、巴西橡膠樹（XM_021820571.1）、陸地棉（XM_ 016896568.1）、中棉（XM_012597405.1）的一致性分別為79%、79%、78%、78%、76%、75%。將杧果與上述6個物種GA2ox氨基酸序列進行多重序列對比，結(jié)果表明，GA2ox氨基酸序列較為保守（圖4）。

圖4 MiGA2ox與其他植物GA2ox同源性的比對Fig.4 Homology alignment of MiGA2ox and GA2ox from other plants

為了研究杧果GA2ox的進化情況，構(gòu)建了GA2ox基因序列的系統(tǒng)進化樹（圖5）。由圖5可見，杧果GA2ox與山黃麻GA2ox1（PON72625.1）、山黃麻GA2ox2（PON57518.1）、川桑GA2ox（XP_010110967.1）、面包樹GA2ox1（ALS88210.1）、面包樹GA2ox2（ALS88211.1）、面包樹GA2ox3（ALS88212.1）親緣關(guān)系較近，其次為蓖麻GA2ox（XP_015574955.1）、麻風(fēng)樹GA2ox（NP_001292962.1）、橡膠樹GA2ox（XP_021649315.1）、木薯GA2ox（XP_021594037.1）、橡膠樹GA2ox（XP_021676263.1）。

2.2 MiGA2ox基因編碼氨基酸序列理化性質(zhì)分析

經(jīng)Protparam（http://web.expasy.org/protparam/） 在線分析，GA2ox序列均含有完整的開放閱讀框，終止密碼子為TGA。GA2ox編碼341個氨基酸，產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為38 729.40 Da，等電點為6.56。其中酸性氨基酸（Asp+Glu）41個，堿性氨基酸（Arg+Lys）39個。該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為80.32，親水性總平均值為-0.301。

Phobius在線分析結(jié)果表明，GA2ox編碼的蛋白質(zhì)可能有信號肽。同時進行GA2ox蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測（圖6）和GA2ox蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖7）。結(jié)果顯示，該蛋白的整條肽鏈均位于細(xì)胞膜外，結(jié)合上述信號肽的預(yù)測，推斷該蛋白在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成后，經(jīng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，直接錨定于細(xì)胞膜外的特定部位行使功能。

利用DNAMAN預(yù)測GA2ox的疏水性，結(jié)果如圖8所示。由圖8可見，GA2ox多肽鏈第91位的谷氨酸具有最低值-3.18，親水性最強；第1位的蛋氨酸具有最高值2.84，疏水性最強。整體來看，親水性氨基酸均勻分布在整個肽鏈中，無明顯的疏水區(qū)域，疏水區(qū)域與親水區(qū)域交替出現(xiàn)，這與不存在跨膜結(jié)構(gòu)域的特征相吻合。

2.3 MiGA2ox基因在隨機時間點的表達(dá)特征分析

在2個隨機時間點進行實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析，測定杧果葉片MiGA2ox基因表達(dá)量，結(jié)果如圖9所示。由圖9可見，在隨機的2個時間點，具有矮化特性杧果品種‘桂熱杧82號’的MiGA2ox基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于喬化品種‘金煌杧’。

2.4 MiGA2ox基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建的GA2ox基因的瞬時表達(dá)載體GA2ox-GFP轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，使用基因槍轟擊擬南芥原生質(zhì)體24 h后，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的信號，結(jié)果如圖10所示。由圖10可見，轉(zhuǎn)GA2ox-GFP載體的綠色熒光分布在細(xì)胞核中。

3 結(jié)論與討論

本試驗中克隆得到廣西地方矮化品種‘桂熱杧82號’GA2ox基因，將該基因命名為MiGA2ox。經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，MiGA2ox編碼蛋白有信號肽、無跨膜結(jié)構(gòu)且無明顯疏水區(qū)域；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，MiGA2ox基因編碼的蛋白位于細(xì)胞核中行使功能；實時熒光定量qRT-PCR分析結(jié)果表明，在隨機的2個時間點，具有矮化特性杧果品種‘桂熱杧82號’中MiGA2ox基因的表達(dá)量均高于其在‘金煌杧’中的表達(dá)量。由此分析得出，‘桂熱杧82號’MiGA2ox基因的高表達(dá)與其矮生性狀有關(guān)。

圖5 MiGA2ox系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of MiGA2ox

圖6 GA2ox編碼蛋白的信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Signal peptide and transmembrane domain analysis of GA2ox encoding protein

圖7 GA2ox編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Secondary structure analysis of GA2ox encoding protein

圖8 GA2ox編碼蛋白疏水性分析Fig.8 Hydrophobicity analysis of GA2ox encoding protein

圖9 ‘桂熱杧82號’和‘金煌杧’中MiGA2ox在不同 時期的表達(dá)量Fig.9 Expression analysis of MiGA2ox in ‘Gui re No.82’ and ‘Jinhuangmang’ during different periods

將約900 bp的3′末端、約400 bp的5′末端和約900 bp的中間片段進行拼接，得到1個2 051 bp 全長序列。由于在酶處理過程中，RNA的3′末端或5′末端可能有個別堿基被消化，導(dǎo)致兩端不完全一致，所以無準(zhǔn)確的3′末端、5′末端和中間片段。RACE的結(jié)果往往是調(diào)取其中一個轉(zhuǎn)錄本的信息，僅是結(jié)果的一種情況，所以不能精準(zhǔn)判斷。本研究中將MiGA2ox基因定位于細(xì)胞核，而GA受體也在細(xì)胞中相同的位點[22-26]。這表明GA2ox可作為GA受體對生物活性GAs具有高親和力，將其轉(zhuǎn)換成失活形式[27]。MiGA2ox基因的亞細(xì)胞定位研究有利于研究其上下游級聯(lián)組分析其在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。利用BLAST進行氨基酸序列相似性檢索分析，MiGA2ox核苷酸序列與橙子、柑橘的同源性最高，達(dá)到79%，與木薯、橡膠樹、陸地棉、中棉的同源性均在75%以上。說明MiGA2ox編碼氨基酸序列具有較高的保守性。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)合其他植物GA2ox序列可知，杧果GA2ox與山黃麻、川桑、面包樹、柑橘親緣關(guān)系較近，與蓖麻、麻風(fēng)樹、橡膠樹、木薯、橡膠樹親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這些分析結(jié)果的獲得可為克隆同源基因提供參考。

圖10 MiGA2ox編碼蛋白在擬南芥原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位Fig.10 Subcellular localization of MiGA2ox encoding protein in Arabidopsis thaliana protoplast

但本研究中未能把模式植物擬南芥與杧果的GA2ox序列進行系統(tǒng)進化比較，不能依據(jù)模式植物擬南芥GA2ox基因的類別來判斷杧果GA2ox基因的所屬類別。另外，本研究中僅隨機比較了2個時間點的MiGA2ox基因表達(dá)量，若選擇開花期、抽芽期及果實成熟期等杧果關(guān)鍵物候期進行實時熒光定量分析，可更全面、準(zhǔn)確地判斷喬化和矮化杧果品種在不同物候期MiGA2ox基因表達(dá)量的變化規(guī)律。根據(jù)‘桂熱杧82號’和‘金煌杧’MiGA2ox基因在不同時期表達(dá)量的對比分析結(jié)果，可以判斷MiGA2ox基因參與調(diào)控矮化性狀的表型，由于目前尚無構(gòu)建成熟的杧果遺傳轉(zhuǎn)化體系，因此下一步的研究方向為利用模式植物煙草進行轉(zhuǎn)MiGA2ox基因的表達(dá)研究，及MiGA2ox基因調(diào)控杧果矮生性狀表型的分子機理。