譚道鵬 杜藝玫 秦 琳 魯艷柳 張倩茹 何芋岐*

1.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義 563009;2.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室(貴州醫(yī)科大學)，貴州 貴陽 550025

大風艾又稱艾納香，為菊科植物艾納香Blumeabalsamifera的干燥地上部分，具有溫中活血、調(diào)經(jīng)、祛風除濕之功效[1]。該藥材主要含揮發(fā)油(單萜)、黃酮、倍半萜類成分[2]，其中黃酮類成分由黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)兩種類型組成[3-5]。目前，艾納香藥材主要用于提取艾片(左旋龍腦)，其黃酮類成分也已被開發(fā)為中藥5類新藥，并進入II期臨床[4]。黃酮類成分具有多種生物活性，如抗氧化[6]、抗心肌缺血[7]等。為綜合開發(fā)利用艾納香中的黃酮類成分，建立快速、準確的艾納香總黃酮含量測定方法具有重要應(yīng)用價值。

中國藥典中總黃酮含量測定方法主要有分光光度法和高效液相色譜法兩種。其中分光光度法又可分為顯色后比色法，如山楂葉中總黃酮的含量測定通過加NaNO2-Al(NO3)-NaOH顯色[8]，消咳喘糖漿中的總黃酮含量通過AlCl3[8]顯色后測定和直接比色法，如淫羊藿中的總黃酮含量測定[8]；高效液相色譜法主要是通過水解后測定主要黃酮苷元，再根據(jù)轉(zhuǎn)換系數(shù)折算出樣品中總黃酮的含量，如銀杏葉中的總黃酮醇苷的含量測定[8]。加入AlNO3或AlCl3顯色可以使黃酮類成分紫外光譜吸收帶I(300～400 nm)波長發(fā)生紅移，從而避免其他成分的干擾，使得總黃酮測定結(jié)果盡可能減少誤差，但由于二氫黃酮類成分其吸收帶I不明顯，不適合采用加Al3+試劑顯色法測定含有二氫黃酮類成分的總黃酮含量。直接比色法適用于主要含有一類成分的藥材，對于本文中含有兩種類型黃酮成分的藥材，因其紫外吸收完全不同，以任一類黃酮的最大吸收波長測定其總黃酮含量都會導致其結(jié)果偏低。銀杏葉中通過水解測定黃酮苷元來折算總黃酮的含量由于經(jīng)過色譜柱的分離，其結(jié)果更為準確，但僅適用于苷元類型相同的黃酮苷類成分。

艾納香中總黃酮的測定方法也有報道，文獻[9]中以蘆丁加NaNO2-Al(NO3)-NaOH顯色后的于500 nm波長處測定，同樣是將黃酮類成分的吸收帶I紅移后測定的，但艾納香中除了黃酮(醇)外，還有二氫黃酮類成分[3-5]，而二氫黃酮類成分的吸收帶I是不明顯的(如圖1)，因此，該方法會導致其總黃酮含量測定結(jié)果偏低。本實驗在前期對艾納香藥材中黃酮類成分研究[3-5]發(fā)現(xiàn)其黃酮類成分主要包括黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)兩種類型，兩種不同類型黃酮的紫外吸收圖譜完全不同(如圖1)，現(xiàn)有文獻測定總黃酮含量的方法主要針對單一類型的黃酮類成分，為此，本文擬探索含有兩種類型黃酮的艾納香中總黃酮含量的紫外測定方法，為以艾納香總黃酮作為有效成分的制劑原料藥材的質(zhì)量控制提供參考。

艾納香藥材中單體有效成分的含量測定也有報道，如：艾納香素和二氫黃酮醇[10]、原兒茶酸[11]等，但這些成分在艾納香中的含量并不高，而含量較高的3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的含量測定方法尚未見報道，并且藥理活性研究表明3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對非小細胞肺癌A549細胞增殖和轉(zhuǎn)移有顯著抑制作用[12]，本文對其進行了HPLC含量測定方法學研究。

1 儀器和試藥

島津UV-2401PC型紫外分光光度計，Agilent 1100 series 高效液相色譜儀(在線脫氣、自動進樣、VWD檢測器、Agilent Chemistation for LC system 色譜工作站)。

蘆丁對照品(批號100080-200707)購自中國藥品生物制品檢定院，3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對照品(批號20150801)為自制，純度經(jīng)NMR、HPLC檢測，其他試劑為分析純。

艾納香藥材分別購自廣西、貴州，經(jīng)作者鑒定為艾納香Blumeabalsamifera，樣品標本保存于遵義醫(yī)科大學藥學院標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮適量，加甲醇制成1 mL中含0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取艾納香藥材粉末0.2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定重量，回流提取60 min，放冷，再稱定重量，以80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品母液，精密吸取供試品母液3 mL，以80%甲醇稀釋到100 mL，作為供試品溶液。

2.1.3 測定波長的選擇 艾納香中的黃酮類成分由黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)四種類型組成，其中，黃酮(醇)類化合物有兩個紫外吸收帶，峰帶I(300～400 nm)和峰帶II(200～280 nm)，代表性化合物如蘆?。欢潼S酮(醇)類化合物的峰帶I很弱，主峰帶II(270～295nm)，代表性化合物如3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮；等濃度的蘆丁與3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮在271 nm處有相等的吸光度(如圖1)，而艾納香中的另外兩類主要成分：揮發(fā)油(單萜)、倍半萜因缺少共軛系統(tǒng)在271 nm不會產(chǎn)生干擾。因此，選擇271 nm為測定波長，采用紫外分光光度法測定艾納香中的總黃酮含量。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密吸取3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對照品溶液0、1、2、3、4、6、8 mL置50 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0 μg/mL對照品溶液為空白，在271 nm處測定上述系列對照品溶液的吸光度。以吸光度y為縱坐標，濃度x(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=23.646x+0.0038；R2=0.9997。結(jié)果表明：3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮在8.26～66.05 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，連續(xù)測定5次，由吸收度計算RSD為0.04%。

2.1.6 重復性試驗 取同一批次艾納香藥材6份，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，分別測定吸收度，并計算出樣品中總黃酮平均含量為12.1%，RSD為1.69%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，在一定時間段內(nèi)(0, 15, 30, 60, 120, 180, 240 min)測定吸收度，計算RSD為0.10%，結(jié)果表明供試品溶液在240 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知總黃酮含量的艾納香藥材6份，分別加入3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對照品，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，分別測定吸收度，并計算出平均加樣回收率為100.51%，RSD為2.57%。

2.2 3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密吸取總黃酮測定項下的對照品溶液2 mL，加80%甲醇稀釋到10 mL，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取總黃酮測定項下的供試品母液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件及適用性試驗 色譜柱：AKZONOBEL Kromasil 100-5C18(4.6×250 mm,5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.4%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min, 45%A; 10～20 min, 80%A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：289 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。色譜圖如圖2所示。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱定3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對照品適量，配置成濃度分別為2.06、4.12、10.32、20.64、41.28、123.84、412.8、825.6 μg/mL的系列對照品溶液，分別精密吸取10 μL，進液相測定，以峰面積y為縱坐標，濃度x(μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=32.418x+27.17；R2=1。結(jié)果表明：3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮在2.06～825.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，連續(xù)測定5次，根據(jù)峰面積計算RSD為0.62%。

2.2.6 重復性試驗 取同一批次艾納香藥材6份，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，分別測定，并計算出樣品中3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮平均含量為1.2%，RSD為1.85%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，在一定時間段內(nèi)(0, 1, 2, 4, 8, 12, 18 h)測定峰面積。結(jié)果表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.40%。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知總黃酮含量的艾納香藥材6份，分別加入3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對照品，按“2.1.2”項下操作，制備成供試品溶液，分別測定，并計算出平均加樣回收率為101.74%，RSD為3.00%。

2.2.9 樣品測定 取3批艾納香藥材分別按上述方法測定其總黃酮及3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮含量，結(jié)果見表2。

表1 總黃酮和3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮加樣回收率

表2 不同批次艾納香藥材中總黃酮和3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮含量

3 討論

分光光度法是一種中藥總成分分析的常用方法，但由于中藥中的成分非常復雜，采用分光光度法測定某一類總成分時極易受到其它類成分的干擾，因此需要對樣品中的化學成分充分的了解，選擇出適合的方法以保證方測定結(jié)果的準確性。黃酮類成分是自然界普遍存在一種重要天然產(chǎn)物，黃酮類成分具有多種多樣的活性，一直受到天然藥物研究學者的關(guān)注。黃酮類成分根據(jù)其結(jié)構(gòu)又可細分為多種類型，如黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)、查爾酮、黃烷、雙黃酮等，艾納香藥材中含有豐富的黃酮類成分，主要以黃酮(醇)、二氫黃酮(醇)兩種類型為主。這兩種類型的黃酮紫外吸收圖譜完全不同(如圖1)，從圖中可以看出以任何一種類型黃酮類成分的最大吸收波長測定其總黃酮含量都會因另一種黃酮類成分在相應(yīng)的最大吸收波長處的吸收值較低而造成測定結(jié)果較實際含量低。等吸收波長是指在某一波長處相同濃度的兩種化學成分具有相同的紫外吸收值，通過配置相同濃度的兩種化學成分分別繪制其紫外吸收圖譜疊加后，在其紫外吸收圖譜交叉處即為這兩種化學成分的等吸收波長。由于相同濃度的不同類型化學成分在等吸收波長處的吸收值是相同的，因此可采用等吸收波長不經(jīng)分離，直接同時測定不同類型化學成分的含量[13- 14]，并減少誤差。通過本實驗發(fā)現(xiàn)蘆丁與3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮有三個等吸收波長，其中271 nm具有較好的吸收，同時又可避免末端波長的干擾，因此選作本實驗測定波長測定艾納香中不同類型黃酮的總含量，方法學研究結(jié)果表明該方法準確、方便、快捷，可以作為藥材、中間體及制劑的控制方法。

實驗過程中分別對總黃酮及3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的提取條件進行了考察，結(jié)果表明0.2 g艾納香藥材采用25 mL80%甲醇回流提取1 h可以提取完全。本實驗對艾納香藥材中的總黃酮及主要黃酮單體化學成分3,3′,5,7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含量分別達到7.2～12.3%及0.8～1.4%，具有非常高的開發(fā)利用前景。