彭陳文 孫茗威 何沛聰 王 森 黃 璇 黃雅麗 張 韌*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006

肺癌對人類的生命健康威脅巨大。由于吸煙、空氣污染等因素，近年來肺癌的發(fā)病率與死亡率持續(xù)上升，在我國，肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率與死亡率均為第一位的惡性腫瘤[1]。近年來化療藥物聯(lián)合中藥已成為治療肺癌的最佳模式?！疤搫t補其母”，中醫(yī)藥多以培土生金法治療肺癌，補脾以養(yǎng)肺，固護正氣。據(jù)臨床文獻報道，健脾理氣法能夠提高和改善肺癌患者的臨床療效和生活質(zhì)量[2]。六君子湯(Liu Junzi Soup,LJS)具有健脾益胃、化痰祛濕、調(diào)暢氣機的功效，臨床上用于晚期肺癌的治療取得了良好的療效[3]，但其抗肺癌的具體機制尚不明確。

近年來興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思維具有整體性與系統(tǒng)性，這與中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用特點相吻合[4-5]，因而適合用于中藥方劑作用機制的研究。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對LJS抗肺癌作用機制進行探討，為其作用機制的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 LJS活性成分遴選 將LJS藥物名稱(人參、茯苓、白術(shù)、甘草、陳皮、半夏)輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫“Herb name”搜索欄里，下載六君子湯相關(guān)藥物活性成分的txt文本，將txt文本引入到excel表格中，獲得LJS藥物成分信息。使用口服生物利用度(OB值)大于20%和藥物相似性(DL值)大于0.18的限定條件對得到的藥物活性成分進行篩選，進而得到LJS活性成分。

1.2 LJS活性成分的靶點預(yù)測 將LJS活性成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫，獲得化學(xué)成分的“Canonical SMILES”，然后將每一成分的“Canonical SMILES”輸入到Swiss Target Prediction靶點預(yù)測平臺，預(yù)測LJS活性成分的潛在作用靶點。

1.3 LJS抗肺癌相關(guān)靶點收集 通過Therapeutic Target Database (TTD)、Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM)、Disease Gene Search Engine (DiGSeE)、Drug Bank及Human Phenotype Ontology(HPO)5個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，以關(guān)鍵詞“Lung Cancer”進行檢索，獲得肺癌相關(guān)的疾病靶點，除去重復(fù)靶點。將收集到的疾病靶點與1.2項下獲得的成分作用靶點進行對比，最后得到LJS抗肺癌相關(guān)作用靶點。

1.4 LJS抗肺癌的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建 將1.3項收集到的LJS抗肺癌的作用靶點輸入到Sring數(shù)據(jù)庫，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩出degree值排名前10的靶點。

1.5 靶點的KEGG通路富集分析 登陸Metascape平臺，輸入LJS抗肺癌作用靶點，選項“Input as species”和“Analysis as species”均選擇“人類(Homo sapiens)”，P值設(shè)為小于0.01，對靶蛋白進行KEGG通路富集分析，根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)中每個條目的P值從小到大進行排序，篩選前10條目，并進行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 LJS活性成分篩選 通過OB>30%，DL>0.18的篩選條件，共得到85個活性成分。半夏12個，包括黃芩素、黃芩苷、豆甾醇、β-谷甾醇等；陳皮4個，包括川陳皮素、柑橘素等；白術(shù)7個，包括白術(shù)內(nèi)酯、β-香樹素、長葉烯、等；茯苓15個，包括茯苓酸、松苓新酸等；人參19個，包括山奈酚、高麗槐素、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rg2等；甘草28個，包括槲皮素、毛異黃酮、黃甘草異黃酮A等。

2.2 LJS活性成分靶點預(yù)測 通過Swiss Target Prediction平臺，刪除重復(fù)項后，共獲得178個活性成分靶點。將178個作用靶點與OMIM、 TTD、DiGSeE、Drug Bank、以及Human Phenotype Ontology(HPO)5個疾病數(shù)據(jù)庫收集到的肺癌相關(guān)基因靶點進行比對，最終得到59個LJS抗肺癌的相關(guān)靶蛋白。

2.3 59個靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將59個靶點的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.2.1軟件繪制靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。此網(wǎng)絡(luò)共有59個節(jié)點，459條邊(“邊”表示兩個靶點存在相互作用關(guān)系)，靶點的degree值越大則形狀越大。該網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10的靶蛋白，分別為絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、熱休克蛋白90α(HSP90α)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體1(ESR1)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、雄激素受體(AR)、基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP9)。

2.4 KEGG通路富集分析 使用Metascape平臺對LJS抗肺癌的59個作用靶點進行KEGG通路富集分析，篩選前10條目(P值從小到大進行排序)，并進行可視化處理，結(jié)果如圖2所示.主要有PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、白介素17信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等。

3 討論

3.1 LJS抗肺癌涉及的重要藥物成分 研究結(jié)果表明，黃芩素、白術(shù)內(nèi)酯、茯苓酸、人參皂苷等是LJS藥物活性成分。黃芩素對肝癌、乳腺癌以及宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞有明顯抑制細(xì)胞增殖的作用[6]。研究表明[7]，黃芩素對肺癌細(xì)胞的增值具有一定抑制作用，其可能通過上調(diào)Caspase - 3蛋白的表達(dá)與下調(diào)urvivin蛋白和Eph A2蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。白術(shù)內(nèi)酯是白術(shù)的主要成分，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種作用[8]。研究顯示[9]，白術(shù)內(nèi)酯可通過抑制TLR4/MyD88通路降低肺癌細(xì)胞侵襲能力與增值能力。人參皂苷是人參的有效成分，其可通過多種途徑增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫能力，具有明顯的抗腫瘤能力[10]。實驗表明[11]，人參皂苷可顯著抑制小鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Lewis細(xì)胞中免疫檢查點程序性死亡分子1配體(PD-L1)的表達(dá)，通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，阻斷由PD-L1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，加強T細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長。

3.2 LJS抗肺癌涉及的重要作用靶點 LJS抗肺癌作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，絲/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、熱休克蛋白90α(HSP90α)、腫瘤壞死因子(TNF)，基質(zhì)金屬蛋白酶 9(MMP9)等10個靶點的Degree值排在59個靶蛋白前10位。AKT被認(rèn)為是一種癌基因，可通過多種途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和凋亡。AKT1是AKT的重要亞型，與胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)病密切相關(guān)。王嘉等[12]研究顯示，AKT1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于肺泡對照組和支氣管對照組，提示AKT1在肺癌的發(fā)生過程中起促癌作用。HSP90α是一種熱休克蛋白，能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的癌基因結(jié)合，維持其致癌性，且分泌到細(xì)胞外的HSP90α可增強腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移[13]。

3.3 LJS抗肺癌涉及的重要生物通路 KEGG信號通路結(jié)果顯示，LJS抗肺癌涉及PI3K-Akt、白介素17、血管內(nèi)皮生長因子等信號通路。PI3K-Akt信號通路是機體內(nèi)主要通路之一，其在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等[14]。倪琛琛等[15]研究100例肺癌組織中PI3K及Akt蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示前兩者在肺癌組織的陽性表達(dá)率均顯著高于相應(yīng)癌旁組織的陽性表達(dá)率。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種活性很強生長因子，對血管的發(fā)生與形成具有促進作用。多種惡性腫瘤中VEGF的表達(dá)水平與患者5年存活率呈負(fù)相關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過分泌VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增值和血管形成，促進腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[16]。

本研究結(jié)果顯示，LJS抗肺癌的過程涉及了多個活性成分、靶點及通路，與中醫(yī)藥診療疾病多成分-多靶標(biāo)-多通路的特點相符合，可作為LJS抗肺癌作用機制的預(yù)測探討，為下一步實驗研究提供思路與參考。