張 震，丁 涵，楊朋坤

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽業(yè)協(xié)會）

紡織染料是一類種類豐富、結(jié)構(gòu)復雜的化學品，通常包括偶氮類、蒽醌類、靛酚、三芳甲烷和雜環(huán)類等多種類型。工業(yè)廢水中殘留的紡織染料的去除已經(jīng)成為水污染治理領域的一個重要研究方向。生物方法處理染料殘留的機制是利用生物產(chǎn)生的酶降解染料?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以降解紡織染料的酶有木質(zhì)素酶過氧化物酶、偶氮還原酶、錳過氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶等。這些酶都是通過對染料特定基團的氧化還原作用對染料進行脫色的。其中研究較多的是漆酶。漆酶是一類可以氧化多種芳香族化合物的多銅氧化酶，其底物廣泛，包括芳香族化合物，ABTs，金屬離子等。從白腐真菌（P. ostreatus）提取的漆酶粗酶對Remazol Brilliant Blue R（RBBR）蒽醌染料的最大脫色效率可達70%，將酶液固定在藻酸銅珠上可以提高酶的重復利用次數(shù)。而真正的工業(yè)廢水中通常是幾種染料混合存在，關于混合染料的脫色報道還不多。最近利用表面展示技術將細菌漆酶錨定在惡臭假單胞菌表面構(gòu)建成重組菌，重組菌對蒽醌類染料酸性綠25 的最大脫色效率為97%，對偶氮類染料酸性紅AR18 的脫色率達到89%。對混合染料的脫色也有同樣的效果，而且這種重組菌可以重利用。

錳氧化物是一種具有強氧化性的氧化劑?；瘜W合成的β-MnO2納米棒在酸性條件下無須過氧化氫即可催化降解堿性桃紅染料，常溫條件下，pH 值在1 左右時，反應90min后染料溶液脫色率達87%；納米結(jié)構(gòu)的ε-MnO2可以用于催化分解苯酚；納米結(jié)構(gòu)的β-MnO2催化降解羅丹明B（Rh B）的降解率為75%；δ-MnO2氧化降解雙酚A的去除率即可達到99%。

雖然生物和化學的方法都可以降解染料，但是都有其局限性。生物的方法降解染料一般都是只針對一種染料或一類染料，而且單純的酶的重復利用性比較差，將酶固定在納米載體上會導致成本升高。純粹的化學降解方法成本高，而且降解率較低。

該實驗室從畜禽廢水中分離得到的一株假單胞菌MYZ68，既可以氧化Mn（II）生成錳氧化物，又具有全細胞漆酶活性，在氧化Mn（II）的同時細菌可以和錳氧化物形成聚集體。該研究利用聚集體同時具有的漆酶氧化活性和錳氧化物的氧化活性及吸附性對復合紡織染料廢水進行脫色研究，并檢測其重復利用率。

1 材料和方法

1.1 材料

假單胞菌MYZ68 為河南牧業(yè)經(jīng)濟學院保存，分離自河南盧氏錳礦場表層土壤。LBB 和ABTs 購買自美國Sigma-Aldrich公司，其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。Lept培養(yǎng)基，30℃，搖床（150 r/min）培養(yǎng)細菌。含錳培養(yǎng)基中Mn（II）的初始濃度為1 mmol/L。染料溶于0.1 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）配制成10 g/L的母液備用。

1.2 細菌全細胞漆酶活性和錳氧化活性的檢測

漆酶的活性測定以ABTS 為底物在25℃下進行。2 mL反應體系包括：100 μL 0.5 mM的ABTS，1.7 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液（pH4.0），100 μL 2 mM 的CuCl2和100μL OD600=1.0 用PBS 重懸的全細胞菌液（收集細胞后，用PBS洗滌3次）。測定420 nm下的吸光度值。1個單位的酶活定義為每分鐘氧化1 umol的ABTS所需的酶量。酶活測定及計算方法參照Bourbonnais 等（Bourbonnais and Paice,1990）描述修改進行。

LBB法測定細菌的錳氧化活性：挑取細菌單菌落于培養(yǎng)基中，按照0.5%～1%的接種量轉(zhuǎn)接到含錳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集1 mL 菌體（12000 r/min,30 s），棄上清，加入50 μL Hepes（10mM），混勻，按1∶5（V∶V）加入0.04%LBB 溶液，避光反應約10 min。反應后，離心（12000 r/min,30 s），取上清測定吸光值（620 nm）。根據(jù)高錳酸鉀標準曲線計算錳氧化物濃度（Zhang et al.,2015）。

1.3 染料脫色實驗

5 mL 反應體系包括：染料500 μL（終濃度為1g/L），3.5 mL 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液，1 mL用PBS重懸的聚集體（收集培養(yǎng)48h的聚集體后，用PBS洗滌3次），反應體系處于25℃。150 r/min搖床中脫色24 h，每1 h取一次樣品，在染料的最大吸收波長處用紫外-可見分光光度計測得脫色率?？瞻讓φ諏嶒炘诓患蛹毦奂w的相同條件下進行。所有測量均重復三次取平均值。

脫色率公式為：脫色率（%）=（A0-A）/A0100%

A0—染料的初始吸光度值

A—經(jīng)過漆酶處理后染料的吸光度值

1.4 持續(xù)脫色實驗

用本實驗所用的聚集體在最適條件下處理染料，這稱之為第一輪脫色。離心收集第一輪脫色的脫色產(chǎn)物，在同樣條件下再脫色染料。這稱之為第二輪脫色。然后離心收集第二輪脫色的脫色產(chǎn)物在含Mn（II）的Lept培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，離心收集聚集體，在最適條件下脫色染料，這稱之為第三輪脫色。分別計算三輪脫色實驗的脫色率。

2 結(jié)果

2.1 細菌MYZ68的全細胞漆酶活性和錳氧化活性

本研究檢測了MYZ68在生長過程中全細胞漆酶活性和Mn（II）氧化活性的變化。MYZ68 在含1mmol/L 濃度的LEPT培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，每4 h取樣檢測其全細胞漆酶活性和錳氧化物濃度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 MYZ68生長過程中的全細胞酶活和錳氧化活性變化曲線

結(jié)果顯示，MYZ68 在生長12 h 后全細胞漆酶活性達到最高，約45 U/mL，而后隨著時間的延長，漆酶活性逐漸降低，在28 h時漆酶活性逐漸穩(wěn)定，約35 U/Ml。MYZ68形成的錳氧化物濃度在28 h 時達到最高，大約95%以上的Mn（II）已經(jīng)被氧化為Mn（IV）。漆酶是形成錳氧化物聚集體的關鍵酶，與游離的漆酶相比，存在于錳氧化物聚集體中的漆酶活性保留的時間更長。

2.2 聚集體對染料進行脫色的影響因子分析

利用聚集體對四種染料進行了脫色研究，分別是偶氮類 染 料 酸 性 紅18（Acid Red 18，AR18）和 活 性 黑5（Reactive Black 5，RB5）、芳基甲烷類染料堿性黃2（Basic Yellow 2，BY2）以及蒽醌類染料酸性綠25（Acid Green 25，AG25）。分別檢測了時間、pH值、溫度和金屬離子對聚集體降解這四種染料的影響。

結(jié)果顯示，聚集體在10 min時對各種染料的脫色即達到一定程度，在40 min時達到最大脫色效果，1 h左右達到穩(wěn)定狀態(tài)。聚集體對偶氮類染料的脫色性能最好，脫色率可達95%以上。對芳基甲烷類染料堿性黃的脫色效果最差，只有70%左右。

脫色體系的pH值在2.0～4.0之間時，聚集體對四種染料的脫色綠最高，最高可達99%。在堿性環(huán)境中，聚集體對染料的脫色率大幅降低。其中偶氮類化合物的脫色率降至55%左右，堿性黃的脫色率最低，只有40%左右。

在25～45 ℃的溫度下聚集體對各種染料的脫色率最高。漆酶的最適溫度在30 ℃左右，這個溫度范圍漆酶的活性較高，菌體的各種吸附性蛋白也有較高的活性，因此脫色作用較強。在45 ℃時游離酶的活性逐步降低，但是在聚集體中由于錳氧化物和菌體的保護，漆酶仍然能夠保持一定的活性，所以聚集體對染料的脫色率也維持在較高水平。隨著溫度的升高，脫色率逐漸下降，到85 ℃時偶氮類染料的脫色率約75%，AG25 和BY2 的脫色降至65%左右。在85℃時，酶的活性已經(jīng)喪失，細菌菌體也極易裂解。

綜上所述，聚集體對染料進行脫色的最優(yōu)條件為pH值3.0，25℃，在1h內(nèi)可以完成對染料的脫色，聚集體對偶氮類染料AR18 和RB5 的脫色效果最好，脫色率可達98%，而對蒽醌類染料AG25 的脫色效果次之，可達80%，對芳基甲烷類染料BY2的脫色效果最差，但是也有75%的脫色率。經(jīng)過聚集體的脫色作用，含染料的水基本上可以達到清澈的效果。

2.3 聚集體對復合染料的脫色

實際生活中的染料廢水經(jīng)常含有不止一種染料，因此檢測了聚集體對多種染料混合體系的脫色率。在最優(yōu)脫色體系中，分別加入總?cè)玖虾繛?g/L的兩種或三種染料的混合物，測定所加入染料的脫色率。

圖2 聚集體對兩種染料混合體系的脫色作用

結(jié)果顯示，聚集體可以完成對含有兩種染料的水體的脫色，但是其脫色作用相對于單色染料作用過程稍慢，需要1h以上才能達到效果（圖2）。

2.4 聚集體對染料的循環(huán)降解

脫色材料的重復利用和可再生性是評價材料性能的重要標準，本文用三輪脫色試驗驗證了聚集體的重復利用和再生性。

結(jié)果顯示，經(jīng)過一次脫色試驗后，直接用于脫色試驗的效果較差，脫色率低于第一輪，但是仍有初始能力的90%，經(jīng)過簡單的培養(yǎng)后，聚集體恢復了脫色能力，在第三輪脫色試驗中的脫色率與第一輪相當。說明該研究所用的MYZ68所形成的聚集體具有良好的再生性和重復利用能力。

3 討論

錳氧化物作為一種納米顆粒材料，具有很高的氧化活性，可以氧化多種有機化合物，并可以吸附多種金屬和有機物。盡管化學合成的錳氧化物可以完全氧化有機物，但是都需要極高的溫度（＞300℃）和嚴格的pH值條件，或需要其他輔助因素。而這些嚴苛的條件在實際的應用中都是極難完全符合的。特別是在大規(guī)模處理污水樣品時，簡單、快速、抗逆、廉價是一種良好的可實際利用的降解方法所必須具備的條件。

漆酶是一種多銅氧化酶，具有強氧化性，可以降解多種有機化合物，底物十分廣泛。漆酶對染料進行脫色的研究很多，但是多數(shù)研究表明，漆酶對染料的脫色并不充分，這在應用中就會造成二次污染，從而限制了漆酶在實際生產(chǎn)中的應用。因此，欲在一個溫和的環(huán)境中徹底去除紡織染料的危害，僅靠漆酶或錳氧化物的氧化等單一的方法難以達到目的。

錳氧化細菌在氧化Mn（II）的過程中可以與錳氧化物形成規(guī)則的聚集體。假單胞菌MYZ68在氧化Mn（II）并形成錳氧化物的過程中，與錳氧化物裹挾在一起，而后更多的細菌再吸附在這個混合物上，從而形成球型聚集體。在聚集體中MYZ68 的全細胞漆酶活性可以存留更長時間，漆酶的降解速度明顯下降。

在錳氧化物聚集體中，細菌的漆酶和錳氧化物都有極強的氧化活性。同時，納米級的錳氧化物和細菌都可以給漆酶提供一個相對穩(wěn)定的微環(huán)境和支撐，使其在一定程度上免受外界因素的干擾，可以在較長時間內(nèi)保持活性，并在pH 值3.0～5.0 的范圍內(nèi)都保持一個相對較高的活性。這比游離的漆酶對pH 的要求要低很多（Shao et al.,2009）。因此，錳氧化物和細菌的混合體系可以在一個相對中性的條件下對紡織染料進行脫色。漆酶對溫度也比較敏感，錳氧化物和細菌給漆酶提供的微環(huán)境和支撐使漆酶對溫度的敏感性有所降低，在45℃時使漆酶依然具有相當?shù)幕钚?。而錳氧化物的降解反應則需要較高的溫度，溫度越高越有利于其對染料的脫色，所以在高溫時，聚集體也依然對紡織染料表現(xiàn)了相當?shù)拿撋饔谩?/p>

聚集體可以迅速對燃料進行脫色，在最適條件下10 min時對偶氮類染料的脫色率即可達到95%以上，40 min時對蒽醌和芳基甲烷類染料的脫色率可以達到75%以上。實驗證實，聚集體這種復合材料極大地克服了純酶或細菌、錳氧化物的缺點，同時揉合了二者的優(yōu)點，對染料的脫色展現(xiàn)出快速和條件溫和的特點。

金屬離子是染料中常用的助劑，對漆酶活性的影響也很大，很多金屬離子在低濃度時就可以降低漆酶的酶活，而在本實驗中，多數(shù)的金屬離子在低濃度時對聚集體脫色作用的影響是不顯著的，這可能是細胞和錳氧化物對漆酶或細菌有一定的保護作用，可以降低金屬離子的傷害。同時，MYZ68 形成的錳氧化物與菌體裹挾在一起，也對漆酶的活性有一定的保護作用，避免外界條件的侵擾。因此，本研究中構(gòu)建的這一新型脫色材料對外界環(huán)境更有抵抗力，可以抵抗較高的溫度和各種金屬離子的影響。

錳氧化物聚集體具有制備簡單、再生過程簡單的特點，只需要簡單的培養(yǎng)就可以制備。這種材料適合大規(guī)模的制備，以用于大量處理水環(huán)境中的染料。而且聚集體的重復利用性和可再生性良好，使用過的聚集體只要經(jīng)過簡單的培養(yǎng)就可以恢復活性，很適合大規(guī)模連續(xù)處理水中的染料。漆酶不僅可以對染料進行脫色，還可以氧化其他多種物質(zhì)，可以用于有機物降解等領域，因此錳氧化物聚集體不僅僅是一種染料脫色材料，還有很大的潛力應用于廢水綜合處理領域。

4 結(jié)論

該研究所用的細菌和錳氧化物的聚集體是一種對各種染料，尤其是偶氮類染料具有良好脫色作用的環(huán)境友好型脫色材料，對偶氮類染料的脫色率可達95%以上，在環(huán)境廢水的綜合治理領域有良好的應用前景。□