稅成愈，向 燦

(1.恩施州中心醫(yī)院西醫(yī)部 婦產(chǎn)科，湖北 恩施 445000；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430000)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居?jì)D科惡性腫瘤第2位[1]，全球每年約26萬女性死于宮頸癌，研究表明宮頸癌的致病因素眾多，目前對(duì)于宮頸癌的發(fā)病具體分子機(jī)制尚不完全清楚[2]。膜相關(guān)RINpCH(Membrane-associated RING-CH，MARCH)家族是屬于E3泛素連接酶的環(huán)指結(jié)構(gòu)域的一類家族，MARCH家族有11名成員。MARCH8(Membrane-associated RING-CH8)是第一個(gè)于哺乳動(dòng)物發(fā)現(xiàn)的MARCH蛋白，有研究顯示MARCH8過表達(dá)會(huì)下調(diào)免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，包括MHC II、B7-2、TfR、CD166、CD88以及CD44等[3-5]。已有研究表明MARCH8介導(dǎo)的TNF相關(guān)細(xì)胞凋亡的下調(diào)(包括誘導(dǎo)TRAIL-R1)已被證實(shí)可以阻止乳腺癌細(xì)胞凋亡，這提示著MARCH8可能成為基因沉默或敲除研究的潛在靶點(diǎn)，為癌癥患者治療提供參考[6]。但是MARCH8對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的報(bào)道較少，因此本文通過本院收集的宮頸癌組織以及體外細(xì)胞MARCH8沉默試驗(yàn)來探索MARCH8對(duì)宮頸癌的影響，并對(duì)其可能存在的機(jī)制進(jìn)行研究，為治療宮頸癌尋找新的分子靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣本材料 選取我院宮頸癌手術(shù)切除標(biāo)本20份作為研究對(duì)象，同時(shí)選取20例正常宮頸組織人群作為對(duì)照。所有患者及其家屬均自愿參與并簽署知情同意書，并經(jīng)過本院倫理委員會(huì)通過，所有組織均于-80℃保存。人宮頸癌細(xì)胞系Hela由上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.1.2 試劑及儀器 MARCH8、血清中Bcl-2、Bax、p53、GAPDH、Ki67、Caspase-3抗體以及抗小鼠/兔IgG(Cell Signaling Technology)，ECL Kit(Thermo Fisher)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，DNR BioImaging System(DNR，Israel)，10%胎牛血清(Sigma-Aldrich)，青霉素(MerckKGaA)，鏈霉素(Darmstadt)，Dulbecco's改良Eagle’s培養(yǎng)基(Thermo Fisher)，Lipofectamine2000(Thermo Fisher)，TRIzolKit(Thermo Fisher)，Revertaid First Strand cDNA Kit(Thermo Fisher)，SYBR-Green PCR(TAKARA)，高速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)，正置熒光顯微鏡(Thermo)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏)。 FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素或鏈霉素的完全Dulbecco's改良Eagle’s培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，并在37℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，0.25%胰蛋白酶消化液處理制成細(xì)胞懸液。

1.1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn) 調(diào)整Hela細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，接種于不含抗生素的培養(yǎng)基6孔板中，培養(yǎng)24 h，采用Lipofectamine2000將siRNA-MARCH8、陰性對(duì)照物(siRNA-NC)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，分別記為MARCH8-RNAi與Ctrl，并采用Western blot以及RT-PCR檢測(cè)MARCH8-RNAi與Ctrl Hela細(xì)胞中MARCH8基因與蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑操作說明進(jìn)行。

1.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取對(duì)數(shù)生長期3種細(xì)胞，將MARCH8-RNAi與Ctrl Hela細(xì)胞懸液密度調(diào)整為3×104個(gè)/mL，接種于96孔板、100 μL/孔，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，重復(fù)2次，培養(yǎng)4h、棄MTT，200 μL DMSO作用30 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm波長下檢測(cè)各孔吸光度A值，以正常Hela細(xì)胞的A值用作調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 將MARCH8-RNAi與Ctrl Hela細(xì)胞懸液密度調(diào)整為2.5×104個(gè)/mL，接種于6孔板中、400 μL/孔、培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，PBS洗滌2次，加入1 mL 75%乙醇、-20℃固定24 h，加入0.4 μL PI(30 mg/mL)混合，避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，ModFit LT分析并擬合計(jì)算各時(shí)期細(xì)胞百分比。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將MARCH8-RNAi與Ctrl Hela細(xì)胞懸液密度調(diào)整為4×104個(gè)/mL，接種于6孔板中、400 μL/孔、培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清液，加入試劑盒中的緩沖液，混勻，再加入5 μL Annex-inV/FITC、10μL PI混合，室溫避光孵育15 min，用于流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)，CellQuest軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 Hoechst 33342體外觀察凋亡小體試驗(yàn) 將無菌的蓋玻片置于6孔板，將MARCH8-RNAi與Ctrl Hela細(xì)胞懸液密度調(diào)整為2.5×105個(gè)/mL，并接種于蓋玻片上，培養(yǎng)48 h收集各組細(xì)胞，已預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入0.2 μL的1 μg/mL Hoechst33342染液，室溫避光15 min，封片，熒光顯微鏡下觀察凋亡小體，圖像收集，采用ImageJ進(jìn)行凋亡小體數(shù)量統(tǒng)計(jì)。

1.6 Western blot檢測(cè)方法 提取培養(yǎng)48 h后MARCH8-RNAi與Ctrl Hela細(xì)胞總蛋白，采用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)PVDF膜，密封2 h，加入兔抗人Bcl-2、Bax、p53、MARCH8、GAPDH一抗(1∶500)4℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL試劑盒與DNR BioImaging System觀察膜上蛋白條帶，收集圖像，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 免疫組織化學(xué)試驗(yàn) 將組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片(4 μm)，牛血清室溫孵育2 h，加入Ki67、Caspase-3、MARCH8一抗人血清4℃孵育過夜，再加入與生物素結(jié)合的二抗室溫孵育3 h，采用二氨基聯(lián)苯胺檢測(cè)反應(yīng)信號(hào)。

1.8 RT-PCR檢測(cè) 用TRIzol試劑分別宮頸癌組織、癌旁正常組織和MARCH8-RNAi組、Ctrl組Hela細(xì)胞的總RNA，Revertaid First Strand cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR-Green PCR Mix 檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。PCR參數(shù)設(shè)置：95℃ 5 s，60℃ 34 s、40個(gè)循環(huán)。相關(guān)基因引物序列(見表1)。

表1 RT-PCR基因引物序列

引物名稱引物序列(5′～3′)引物位置(bp)GAPDH5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′ 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′471～811MARCH85′-TGCATCAGATCTCTGCCATT-3′5′-TGGACGTCATCTGCAACTTC-3′5′-GTCTACGGCCATACCACCCTG-3′5′-AAAGCCTACAGCACCCGGTAT-3′2026～20401PCNA5′-GGGCGTCAACCTAAACAGCA-3′5′-TCCACAA CGAGAG GAACCTCTG-3′10165～10306CDK25′-GCTTTCTGCCATTCTCATCG-3′5′-GTC CCC AGA GTCCGAAA GAT-3′10313～10341CyclinD15′-GCGTTGCTCTGATGGTGA-3′5′-CAG CGT GATGATGGTAGG-3′751～820

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織MARCH8表達(dá)水平 免疫組化結(jié)果顯示MARCH8在宮頸癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于正常宮頸組織(P<0.01，見圖1)。

A：MARCH8在正常宮頸組織與宮頸癌組織中免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)；B：A圖MARCH8陽性表達(dá)率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與正常宮頸組織對(duì)比，**:P=0.004。圖1 宮頸癌組織MARCH8表達(dá)水平

2.2 宮頸癌Hela細(xì)胞MARCH8-RNAi驗(yàn)證 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中MARCH8蛋白水平顯著低于其陰性對(duì)照(Ctrl)(P=0.0006，見圖2A、B)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示MARCH8在MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞表達(dá)下調(diào)(P=0.0004，見圖2C)。

A：MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)MARCH8的Western blotting凝膠成像結(jié)果；B：A圖MARCH8蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C:MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)MARCH8的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，與Ctrl對(duì)比，**:P=0.003,***:P=0.001。圖2 宮頸癌Hela細(xì)胞MARCH8-RNAi驗(yàn)證

2.3 MARCH8-RNAi抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞增殖率下降至55%，明顯低于Ctrl(P=0.006,見圖2A)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞處于G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，且高于Ctrl(P=0.005)，而S期及G2、M期的細(xì)胞比例均低于Ctrl(P=0.005，見圖2B)；采用RT-qPCR檢測(cè)Ctrl Hela細(xì)胞及MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中PCNA、CDK2、CyclinD1表達(dá)水平，結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中的PCNA、CDK2、CyclinD1表達(dá)水平均低于Ctrl(P=0.001，見圖3C)。

2.4 MARCH8-RNAi促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡 Hoechst 33342檢測(cè)結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中的凋亡小體數(shù)目顯著高于Ctrl(P=0.001,見圖4)；免疫組化結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中Ki67陽性表達(dá)率明顯低于Ctrl，而Caspase-3的陽性表達(dá)率顯著高于Ctrl(P=0.007,見圖5)；流失細(xì)胞儀結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞凋亡率升高，而存活率降低，與Ctrl差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008,見圖6A)；Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中Bax、p53蛋白水平明顯高于Ctrl(P=0.001)，而Bcl-2蛋白水平低于Ctrl(P=0.005,見圖6B、C)。

A： MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)細(xì)胞增殖率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B：MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)中處G0/G1、S、G2/M期的Hela細(xì)胞數(shù)目數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C:MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)Hela細(xì)胞中PCNA、CDK2、CyclinD1RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，與Ctrl對(duì)比，*:P=0.005,**:P=0.001。圖3 宮頸癌Hela細(xì)胞MARCH8-RNAi驗(yàn)證

A： MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)凋亡小體鏡檢結(jié)果(×200)；B：A圖的凋亡小體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與Ctrl對(duì)比，***:P=0.001。圖4 MARCH8-RNAi促進(jìn)凋亡小體形成

A：MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)細(xì)胞中Ki67、Caspase-3免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)；B：A圖的Ki67、Caspase-3陽性表達(dá)率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；與Ctrl對(duì)比，**:P=0.001。圖5 MARCH8-RNAi對(duì)Ki67、Caspase-3的影響

A：MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)細(xì)胞存活率及凋亡率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；B：MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞及其陰性對(duì)照組(Ctrl)細(xì)胞中Bcl-2、Bax、p53的Western blotting檢測(cè)凝膠成像結(jié)果；C：B圖的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與Ctrl對(duì)比，**:P=0.001。圖6 MARCH8-RNAi對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)主要報(bào)道了MARCH8在免疫調(diào)節(jié)方面的作用，而關(guān)于MARCH8與癌癥的相關(guān)性的還未完全闡明，有研究顯示MARCH8高表達(dá)與食道腫瘤有關(guān)[7]，本文將我院收集到的宮頸癌組織與正常宮頸組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)MARCH8蛋白水平，結(jié)果顯示宮頸癌組織中MARCH8蛋白水平顯著高于正常宮頸組織，提示MARCH8可能也參與宮頸癌組織的形成。本研究通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將MARCH8-RNAi轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細(xì)胞，蛋白免疫印跡及RT-PCR結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞中MARCH8基因及蛋白水平顯著低于其陰性對(duì)照組，表明對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的MARCH8沉默成功。

沈妮等[8]研究顯示乳腺癌MCF-7細(xì)胞RNAi敲減MARCH6基因后，MCF-7細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期G1期受阻滯，提示MARCH6可通過影響細(xì)胞周期進(jìn)展來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。有研究顯示MARCH6、MARCH8的重要同源基因均是MARCH2[9-10]，提示著MARCH8是否也能通過影響細(xì)胞周期來參與癌癥細(xì)胞增殖。CDK2主要作用于G1期與S期，對(duì)DNA修復(fù)、促進(jìn)有絲分裂具有重要意義，其高表達(dá)有利于細(xì)胞增殖[11]，PNCA是一種促進(jìn)DNA延伸的核蛋白[12]，細(xì)胞周期素1(CyclinD1)的表達(dá)水平直接影響細(xì)胞增殖，其高表達(dá)會(huì)使細(xì)胞G1期時(shí)間縮短而快速進(jìn)入S期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖出現(xiàn)異常[13]，有研究表明CyclinD1能與多種癌基因協(xié)同促使細(xì)胞癌變[14]。Ki-67是一種增殖細(xì)胞核抗原，其表達(dá)與細(xì)胞分裂具有密切關(guān)系，因此Ki-67是反映細(xì)胞增殖情況的理想標(biāo)記物[15]。本文結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞增殖率降低、處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增加，并且CDK2、PNCA及CyclinD1表達(dá)量降低，且Ki67蛋白水平降低，說明MARCH8-R NAi可以通過下調(diào)CDK2、PNCA、Ki67及CyclinD1水平，使Hela細(xì)胞G0/G1期阻滯，延長Hela細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制Hela細(xì)胞增殖。

Bcl-2可通過線粒體途徑來調(diào)控細(xì)胞凋亡[16]，Bax是重要的促凋亡基因，Bax、Bcl-2的比例決定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)[17]，Bax、Bcl-2在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中起拮抗作用[18]。Caspases-3為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白，其表達(dá)與活性直接決定腫瘤細(xì)胞的凋亡狀態(tài)[19]。P53為抑癌基因，對(duì)腫瘤生長具有抑制作用[20]。已有研究顯示MARCH可以調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白水平[21-22]，本文研究結(jié)果顯示MARCH8-RNAi Hela細(xì)胞的凋亡小體與細(xì)胞凋亡率均增加，Bcl-2蛋白水平降低，而Caspase-3、Bax、p53蛋白水平升高，表明MARCH8-R NAi可以通過降低Bcl-2蛋白被表達(dá)、增加Bax、Caspases-3以及P53蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡小體形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可能原因是Bax與p53蛋白在線粒體膜上結(jié)合增加，導(dǎo)致線粒體膜孔道形成增多，使線粒體穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，從而加快細(xì)胞凋亡。

綜上所述，MARCH8在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，MARCH8RNAi一方面可以通過降低CDK2、PNCA、CyclinD1、Ki67表達(dá)水平，阻礙人宮頸癌Hela細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制細(xì)胞增殖；另一方面MARCH8RNAi還可以通過增加Bax、Caspases-3、P53蛋白水平，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡。然而，關(guān)于MARCH8是怎樣調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)的機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。