金東梅，李天禹，宋傳鵬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563099; 2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)科，貴州 遵義 563099; 3.鄒城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 鄒城 273500)

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見的內(nèi)分泌疾病之一，常表現(xiàn)為稀發(fā)排卵或無排卵、高雄激素血癥、月經(jīng)失調(diào)、不孕及卵巢多囊改變，常伴有胰島素抵抗和肥胖等癥狀，在育齡期婦女發(fā)病率為6%～10%，其中的34.1%～43.3%伴有肥胖體征[1-3]。目前對于PCOS的發(fā)病機制仍不明確，治療效果欠佳。根據(jù)PCOS癥狀特點及體征表現(xiàn)，在中醫(yī)分型中主要為痰濕型，在動物造模研究中以肥胖、胰島素抵抗模擬痰濕型PCOS模型。結(jié)合加味啟宮丸(Modified Qigong Pill,MQP)在臨床上治療痰濕型PCOS患者收到理想效果[4-5]，擬研究MQP對肥胖型PCOS模型小鼠血清卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH) 、促黃體生成激素(Luteinizing hormone,LH) 的干預(yù)作用，及對卵巢組織的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼料 56只SPF級、23日齡雌性KM小鼠，體質(zhì)量(20.06±1.15)g，購買于中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(許可證號：SCXK(軍)2012-0011)。將所有小鼠置于遵義醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心(許可證號：SCXK(黔)2018-0002)、屏障環(huán)境內(nèi)喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為恒溫(20±2)℃，相對濕度(65±15)%，每日光照12 h，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d。高脂高糖飼料(購自遵義醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)。

1.2 實驗試劑與儀器 硫酸脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)、注射用大豆油、鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、檸檬酸鈉緩沖液(均購自源葉生物有限公司)，F(xiàn)SH放射免疫試劑盒(【批準文號】國藥準字S10950154，批號：20180920)、LH放射免疫試劑盒(【批準文號】國藥準字S10950161，批號：20180918)(均購自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)。MQP組方(白芍10 g、蒼術(shù)10 g、枸杞10 g、車前子10 g、當(dāng)歸10 g、炒白術(shù)15 g、茯苓15 g、法半夏10 g、川芎10 g、陳皮10 g、炒山楂10 g、神曲10 g、薏苡仁10 g、菟絲子15 g、牛膝10 g、香附15 g，生藥由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，由遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生藥教研室楊建文教授鑒定，均為正品。并由遵義醫(yī)科大學(xué)藥理實驗室協(xié)助煎煮、過濾，濃縮至每1 mL相當(dāng)于生藥18 g)。BX53顯微鏡(OLYMPUS)，MJN-681C電子天平(甬衡電子衡器有限公司)，SW-CJ-1B超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，GC-2010γ放射免疫計數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物建模與分組 將56只小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組13只，造模組43只，43只造模組小鼠按邢佳等[6]的造模方法予以高脂高糖飼料喂養(yǎng)同時每只小鼠頸背部皮下注射9 mg/100 g DHEA油溶液0.1 mL，連續(xù)20 d后，禁食12 h，予腹腔注射120 mg/kg STZ 檸檬酸鈉溶液 0.1 mL/10 g 1次，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)14 d。第15日，禁食12 h后，在正常組及造模組中隨機選取3只小鼠，用放射免疫法檢測到造模組小鼠血清LH水平、FSH水平與正常組小鼠血清LH、FSH水平不一致，用H&E染色顯微鏡觀察造模組小鼠卵巢組織學(xué)與正常組小鼠組織學(xué)檢查有區(qū)別，即判斷造模成功。小鼠造模成功后，將40只造模組小鼠分為PCOS對照組10只、MQP低劑量組(MQP-L)10只、MQP中劑量組(MQP-M)10只、MQP高劑量組(MQP-H)10只。

1.3.2 加味啟宮丸干預(yù) 正常組、PCOS對照組、MQP-L、MQP-M、MQP-H各組均予以常規(guī)飼料喂養(yǎng)、每日分別灌服蒸餾水0.3 mL、蒸餾水0.3 mL、11.57 g/kg MQP 0.3 mL、23.14 g/kg MQP 0.3 mL、46.28 g/kg MQP 0.3 mL，連續(xù)灌服15 d。

1.3.3 指標檢測及方法 藥物干預(yù)15 d，禁食12 h后稱量各組小鼠體質(zhì)量，斷頭取血法處死小鼠并采集標本。用放射免疫分析法測定小鼠血清中的FSH、LH含量(操作步驟按試劑盒說明書進行)。摘取小鼠卵巢組織，制作石蠟切片，H&E染色后，在光學(xué)顯微鏡下比較各組小鼠卵巢組織形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 正常組小鼠毛色白亮柔順，胡須細密，對外界刺激反應(yīng)靈敏，動作迅速。造模結(jié)束后造模組小鼠毛色晦暗，對外界刺激反應(yīng)較遲鈍，胡須變粗，細密度減少，動作遲鈍，活動較少。用藥后，MQP-L、MQP-M小鼠毛色較用藥前柔順，活動較用藥前增多，反應(yīng)較用藥前靈敏；MQP-H小鼠毛色暗淡無明顯改善，對外界刺激無明顯反應(yīng)，進食等動作較遲鈍。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量比較 PCOS對照組體質(zhì)量明顯增加，明顯高于正常組，組間有顯著差異(P<0.05)；MQP-L組、MQP-M組體質(zhì)量也有增加，與PCOS對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MQP-H體質(zhì)量與正常組、PCOS對照組、MQP-M體質(zhì)量組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 各組小鼠血清激素水平比較 PCOS對照組小鼠血清LH水平明顯高于正常組及各MQP干預(yù)組，且與正常組及各干預(yù)組之間比較，血清LH水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MQP-L組、MQP-M組、MQP-H組小鼠之間血清LH水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PCOS對照組小鼠血清FSH含量明顯低于正常組及各MQP干預(yù)組，且與正常組和各干預(yù)組比較，血清FSH水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。MQP-L組與MQP-M組、MQP-H組小鼠之間血清FSH水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。MQP-L、MQP-M、MQP-H的LH值、FSH值與給藥劑量無明顯相關(guān)性(rs=-0.266，P>0.05；rs= 0.126，P>0.05)。

組別干預(yù)后體質(zhì)量(g)LH(mIU/mL) FSH(mIU/mL)正常24.95±1.7163.77±2.67 2.53±0.17PCOS對照34.40±1.16?329.57±9.58?1.87±0.29?MQP-L33.83±0.49?72.60±0.89# 3.95±0.69#MQP-M34.40±1.57?68.13±3.52# 2.87±0.28#★MQP-H31.85±1.17?#▲79.85±13.31#3.24±0.50#★

與正常組比較，*：P<0.05；與PCOS對照組比較，#：P<0.05；與MQP-L比較，★：P<0.05；與MQP-M比較，▲：P<0.05。

2.4 各組小鼠卵巢組織形態(tài)比較 PCOS對照組卵泡多呈囊性擴張，原始卵泡增多，顆粒層細胞排列稀疏，層數(shù)為4～5層，黃體數(shù)量減少。與PCOS對照組相比，MQP-L小鼠原始卵泡數(shù)量減少，可見成熟卵泡和少量黃體，顆粒細胞數(shù)增加，為6～7層。MQP-M原始卵泡及次級卵泡較多，卵泡囊性擴張減少，顆粒層細胞比較整齊，層數(shù)5～6層，可見黃體。MQP-H原始卵泡及次級卵泡明顯增多，優(yōu)勢卵泡形成，顆粒層細胞排列整齊緊密，為4～5層，黃體組織較少(見圖1)。

A、A1:正常組; B、B1:PCOS對照組; C、C1:MQP-L; D、D1:MQP-M; E、E1:MQP-H;下一欄圖為上一欄圖中實線箭頭處放大到400倍時的鏡下觀(A、B、C、D、E ×100，A1、B1、C1、D1、E1 ×400)。圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)

3 討論

PCOS發(fā)病機制可能和下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常、自主神經(jīng)功能紊亂及肥胖、遺傳、環(huán)境、心理因素等有關(guān)[7-10]。

中醫(yī)學(xué)理論認為PCOS病位在腎，與肝、脾二臟功能失調(diào)有關(guān)。脾虛失卻運化，水濕內(nèi)停，痰濁內(nèi)壅，阻滯宮胞，干擾腎氣-天癸-沖任-胞宮生殖軸，涉及胎孕。臨床上采用燥濕化痰方劑如蒼附導(dǎo)痰湯等治療[11-12]。已有研究，化痰法可改善PCOS患者月經(jīng)周期，降低其體質(zhì)量[13]，可上調(diào)PCOS模型大鼠的肝臟組織、卵巢黃素化顆粒細胞胰島素受體底物-1、卵巢黃素化顆粒細胞胰島素受體底物-2 mRNA和蛋白表達水平，減輕PCOS大鼠體質(zhì)量和卵巢質(zhì)量[14-15]。

“加味啟宮丸”主治痰濕阻滯，兼夾脾腎虛弱、肝陰不足之證。方中炒白術(shù)、蒼術(shù)、法半夏、陳皮健脾燥濕；茯苓、薏苡仁除濕和中；白芍、當(dāng)歸養(yǎng)血斂陰；菟絲子、枸杞子走肝、脾、腎經(jīng)，滋肝補腎；牛膝歸肝、腎經(jīng)，引血下行；車前子入足厥陰以行血，入足太陽以利水，與牛膝相配引血下行，使?jié)駶岬美瑢m胞得充；香附、炒山楂、神曲理氣消滯；川芎散郁和血，沖任氣血調(diào)和，利于受孕。

運用DHEA聯(lián)合高脂高糖飼料及STZ誘導(dǎo)建立肥胖型PCOS小鼠模型，造模組小鼠體質(zhì)量明顯升高，高LH血癥，卵巢囊性擴張的卵泡數(shù)較多，顆粒細胞層變薄甚至消失，卵巢呈多囊樣改變，符合PCOS的特征性變化，結(jié)果與邢佳和李燕報道一致[6,16]，表明造模成功。過食高脂高糖飼料則困遏脾土，脾失健運，濕濁內(nèi)生，氣機阻滯，釀濕生痰，故表現(xiàn)為肥胖等，即模型小鼠體質(zhì)量增加。MQP干預(yù)后，MQP-H組小鼠體質(zhì)量顯著降低，且與PCOS對照組小鼠之間差異明顯，而PCOS對照組與MQP-L、MQP-M小鼠之間比較無明顯差異，表明MQP調(diào)節(jié)肥胖型PCOS小鼠體質(zhì)量可能與其濃度相關(guān)。MQP中炒白術(shù)健脾運濕，配蒼術(shù)燥濕健脾，加陳皮、法半夏化痰除濕，佐牛膝歸肝、腎經(jīng)，引血下行，表現(xiàn)為改善肥胖型PCOS小鼠的體質(zhì)量，具體有效劑量閾值及作用機制有待進一步研究。

垂體FSH/LH分泌紊亂，導(dǎo)致卵巢間質(zhì)細胞及卵泡細胞增生，分泌功能異常等，使卵泡成熟障礙、排卵障礙，最終使卵巢呈多囊樣改變[17]。去除痰濕方法可改善PCOS患者LH、睪酮(T)水平及LH/FSH比值，并增加子宮內(nèi)膜容受性及外周組織對胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗[18-19]。本實驗結(jié)果顯示，各治療組小鼠卵巢形態(tài)都比PCOS對照組更接近于正常，表明MQP對肥胖型PCOS模型小鼠卵巢形態(tài)有改善作用。PCOS實驗組小鼠胡須粗經(jīng)MQP干預(yù)后得到一定程度改善，考慮可能與血清LH降低有關(guān)。各MQP干預(yù)組與肥胖型PCOS對照組相比，LH明顯降低，F(xiàn)SH明顯升高，提示MQP可改善小鼠血清LH、FSH水平，但改善程度與用藥劑量無明顯相關(guān)關(guān)系，需進一步研究以明確有效閾值劑量及作用機制，同時為確保MQP安全性，擬將研究MQP藥物副作用、毒性反應(yīng)等。

綜上所述，MQP可有效降低肥胖型PCOS模型小鼠體質(zhì)量、血清LH水平，提高血清FSH水平，改善模型小鼠卵巢組織形態(tài)。