鹿保鑫，林欣梅，李艷清

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319）

豌豆（Pea）起源于亞洲西部、地中海地區(qū)，具有2 000多年的栽培歷史，分布于世界60多個國家，其中大部分國家生產(chǎn)的是青豌豆。我國豌豆資源豐富，產(chǎn)量高、種植面積大，豌豆年產(chǎn)量為150萬t，占世界豌豆總量的8%[1]。豌豆是一種營養(yǎng)豐富的豆類資源，蛋白質(zhì)含量高于20%，脂肪含量在0.5%～2.5%之間，淀粉含量約為50%，粗纖維含量約為5%，由營養(yǎng)成分組成可知，豌豆是一種高蛋白、低脂肪產(chǎn)品，且氨基酸比例利于人體消化吸收，有抑制“文明病”發(fā)病率的功能，符合大眾消費需求，深受消費者的青睞[2]。但目前我國豌豆蛋白利用率極低，豌豆深加工主要產(chǎn)品為淀粉，豌豆蛋白以副產(chǎn)物形式，隨著殘渣流走，不僅造成豌豆蛋白資料浪費，且易污染環(huán)境[3]。因此，需要綜合研究豌豆蛋白的改性技術(shù)，擴大優(yōu)質(zhì)蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，對提高豌豆蛋白的附加值具有重要意義。

目前豌豆蛋白的改性技術(shù)有物理、化學和酶解法，其中糖基化改性屬于化學改性范疇，因易于操作、成本低廉、反應(yīng)時間短，更重要的是糖基化對蛋白質(zhì)改性效果比較顯著，應(yīng)用范圍不斷擴大，備受學者關(guān)注[4-7]。為此，選擇麥芽糊精為糖基化改性用糖，以豌豆蛋白為原料，利用單因素和二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗，對豌豆蛋白糖基化改性工藝進行優(yōu)化，希望可優(yōu)化出適合豌豆蛋白改性的最佳工藝，為豌豆蛋白資源的綜合利用提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

豌豆選購于大慶市九區(qū)批發(fā)市場、麥芽糊精購于中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均購于沈陽市華東試劑廠。

1.2 主要儀器

電子分析天平，揚州鴻都電子有限公司；CTK120多管低溫自動離心機，江蘇世博儀器有限公司；UV752紫外可見分光光度計，深圳歐克儀表科技有限公司；DZKW電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 豌豆分離蛋白的制備

豌豆經(jīng)浸泡12 h后，經(jīng)手工去皮后磨漿，用2 mol·L-1LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為9，在室溫下對其溶液攪拌20 min，用低溫高速離心機離心30 min，取其上清液用2 mol/HCl調(diào)節(jié)pH為4，再用低溫離心機離心30 min，待沉淀后加水分散，用2 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性，最后在-50℃下真空冷凍干燥，用凱氏定氮法對豌豆蛋白進行純度檢測，得到豌豆分離蛋白純度為80.5%，留存?zhèn)溆肹8-9]。

1.3.2 豌豆蛋白糖基化的制備

將一定量的豌豆分離蛋白與麥芽糊精糖按照1∶1的比例溶于去離子水中，磁力攪拌棒在室溫下攪拌30 min 后，用 0.2 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.5）調(diào)節(jié)不同pH至7.0，將樣液置于70～80℃水浴鍋中進行反應(yīng)，水浴反應(yīng)時間約為70 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速用冰水冷卻至室溫，再用8 000 r·min-1高速離心機處理10 min，抽濾處理除去樣液中的不溶解物質(zhì)，取其上清液放入透析袋中，在4℃條件下透析48 h，最后冷凍干燥備用。以未進行糖基化豌豆蛋白與麥芽糊精的接枝度作為對照[10-12]。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗

探討以不同pH、蛋白-糖質(zhì)量比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度四個因素對豌豆蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)接枝度和褐變的影響。以未進行豌豆蛋白糖基化反應(yīng)作對照[13]。

（1）pH對糖基化反應(yīng)接枝度和褐變程度的影響。調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液 pH 分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，控制蛋白與糖的比例為1∶1，反應(yīng)溫度為70℃，控制糖基化反應(yīng)時間為5 h，測定反應(yīng)物的接枝度和褐變程度。

（2）蛋白與糖的比例對糖基化反應(yīng)接枝度和褐變程度的影響。調(diào)節(jié)pH分別為7.0，控制蛋白與糖的比例為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，反應(yīng)溫度為 70 ℃，控制糖基化反應(yīng)時間為5 h，測定反應(yīng)物的接枝度和褐變程度。

（3）反應(yīng)溫度對糖基化反應(yīng)接枝度和褐變程度的影響。調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液pH分別為7.0，制蛋白與糖的比例為 1∶1，反應(yīng)溫度為 60、65、70、75、80、85 ℃，控制糖基化反應(yīng)時間為5 h，測定反應(yīng)物的接枝度和褐變程度。

（4）反應(yīng)時間對糖基化反應(yīng)接枝度和褐變程度的影響。調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液pH分別為7.0，制蛋白與糖的比例為1∶1，反應(yīng)溫度為70℃，控制糖基化反應(yīng)時間為 30、40、50、60、70、80 min，測定反應(yīng)物的接枝度和褐變程度。

1.4.2 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇pH、蛋白-糖質(zhì)量比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度四個因素為自變量，分別以X1、X2、X3、X4 表示，以產(chǎn)物的接枝度為響應(yīng)值，優(yōu)化豌豆蛋白改性糖基化工藝的最佳參數(shù)[14-15]。設(shè)計類型為四因素三水平共29個試驗點，其中5個為中心試驗，24個為析因試驗，具體因素水平編碼情況見表1所示。

1.4.3接枝度測定

參照沙金華[15]方法略有適當調(diào)整。稱取麥芽糊精糖基化改性豌豆蛋白樣液125 μL，加入pH值8.2濃度為0.21 M的磷酸緩沖溶液2 mL，將上述溶液混合均勻后加入濃度為0.01%TNBS溶液2 mL，振動搖勻后，放置在50℃恒溫水浴鍋中避光處理60 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.1 mol·L-1NaSO32 mL，待試樣在室溫下冷卻30 min，用紫外分光光度計在420 nm處測定吸光度值，記錄為At，同時按照相同方法，以未經(jīng)麥芽糊精糖基化處理的豌豆蛋白溶液樣品作空白對照。接枝度可以用此公式計算：

接枝度=［（A0-At）/A0］×100

其中：A0：未經(jīng)改性豌豆蛋白溶液的吸光值；

At：麥芽糊精糖基化改性豌豆蛋白溶液的吸光值。

1.4.4 褐變度測定

褐變度按照文獻[16]中方法測定，取50 μL糖基化豌豆蛋白樣品于試管中，加入0.2 mol·L-1磷酸鹽溶液3.8 mL（pH7.5），同時用 4 mL 磷酸鹽溶液（pH7.5）為空白對照，之后在420 nm下測定樣品的測吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗中涉及的單因素及糖基化改性豌豆蛋白功能特性的數(shù)據(jù)采用SPASS18.0進行顯著性分析，四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計及結(jié)果分析運用的是相應(yīng)面設(shè)計專家（Design Expert 10）進行處理，每個數(shù)據(jù)都是3次平行樣的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對糖基化接枝度的影響

按照反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間60 min，豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比1∶1的條件下進行糖基化反應(yīng)，考察pH值對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響。結(jié)果如圖1所示：

圖1 pH值對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響Fig.1 Effect of pH value on glycosylation degree of pea protein

由圖1可知，隨pH值的增加，反應(yīng)接枝度呈先緩慢下降后有所上升趨勢，褐變逐漸增加，pH值達到8.5增高與pH值8相比相差較大。pH值超多7.0后，豌豆蛋白的溶解度增加，當pH為8.0時，蛋白溶解度最大，與麥芽糊精的反應(yīng)幾率最大，接枝度最高。當pH值達到8.5以上，發(fā)現(xiàn)接枝度出現(xiàn)下降情況，分析原因可能是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在過堿的條件下會發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的變性，阻礙反應(yīng)的進行[17]。所以綜合接枝度和褐變兩個因素，最佳pH值確定為8.0。

2.2 豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比對糖基化接枝度的影響

按照反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間60 min，pH值8.0的條件下進行糖基化反應(yīng)，考察豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響。結(jié)果如圖2所示：

由圖2可知，豌豆蛋白糖基化接枝度隨豌豆蛋白與麥芽糊精比例的改變，隨著麥芽糊精占比的增加，接枝度呈現(xiàn)先顯著增加后顯著下降的趨勢，褐變整體出現(xiàn)逐漸上升變化。當豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比為1∶1時接枝度為28.7%，達到最大。隨之麥芽糊精比例再次同比增加，接枝度反而下降。因隨著麥芽糊精質(zhì)量比的增加，豌豆蛋白與糖的接觸機會增大，出現(xiàn)接枝度持續(xù)上升的情況，但當麥芽糊精質(zhì)量過大，糖分子過多，溶液黏性隨之增加，反而不利于糖基化反應(yīng)進行，接枝度出現(xiàn)下降，同時兩者配比不適當，也會加速美拉德反應(yīng)，使褐變程度增加[18]。所以確定最佳豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比為1∶1。

圖2 豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比對接枝度的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of pea protein to maltodextrin on the degree of branching of pea protein to maltodextrin

2.3 反應(yīng)時間對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響

按照反應(yīng)溫度60℃，pH值8.0，豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比1∶1的條件下進行糖基化反應(yīng)，考察反應(yīng)時間對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響。結(jié)果如圖3所示：

圖3 反應(yīng)時間對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響Fig.3 Effect of reaction time on glycosylation degree of pea protein

由圖3可知，隨著反應(yīng)時間的延長，接枝度出現(xiàn)先緩慢增加后有所下降的趨勢，超褐變隨反應(yīng)時間增加逐漸增加。當反應(yīng)時間為70 min接枝度最高，為26.7%。當反應(yīng)時間為80 min接枝度反而下降。分析其原因，可能與美拉德反應(yīng)有關(guān)，因反應(yīng)時間會影響到美拉德反應(yīng)發(fā)生路徑及產(chǎn)物的組成，隨著加熱的進行，反應(yīng)時間的延長，豌豆蛋白中多肽分子和麥芽糊精發(fā)生美拉德反應(yīng)，不斷產(chǎn)生接枝產(chǎn)物，所以導(dǎo)致前期接枝度不斷增加，但隨著反應(yīng)時間的延長，豌豆蛋白的肽鍵會出現(xiàn)斷裂，使蛋白發(fā)生聚合，自由基將會不同程度的被包埋，進而出現(xiàn)接枝度下降的現(xiàn)象[19]。所以選擇最佳時間為70 min。

2.4 反應(yīng)溫度對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響

按照pH值8.0，豌豆蛋白與麥芽糊精質(zhì)量比1∶1，反應(yīng)時間60 min的條件下進行糖基化反應(yīng)，考察反應(yīng)溫度對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響。結(jié)果如圖4所示：

由圖4所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，接枝度呈現(xiàn)先緩慢增加后下降趨勢，當反應(yīng)溫度在70～80℃之間，接枝度升高很明顯，說明溫度對接枝反應(yīng)速度有十分重要影響。當溫度達75℃時接枝度為28.9，當升高至85℃，接枝度顯著下降。分析原因可能是，隨著溫度的上升，豌豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)會逐漸變得疏松，使蛋白水解度和乳化性隨之增加[18]，加速了分子間運動速度，使豌豆蛋白與麥芽糊精的接觸機會增加，出現(xiàn)接枝度隨溫度升高而增加的情況，但當溫度過高，蛋白質(zhì)會出現(xiàn)糊化和熱變質(zhì)，同時蛋白大分子也會發(fā)生聚集，致使接枝度降低。另外，因持續(xù)的升溫，促進了美拉德反應(yīng)，使褐變程度加深。因此，綜合考慮選擇75℃作為下一步優(yōu)化的最佳反應(yīng)溫度。

圖4 反應(yīng)溫度對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on glycosylation degree of pea protein

2.5 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.5.1 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計方案及結(jié)果

通過Design-Expert8.0軟件對豌豆蛋白糖基化改性工藝進行設(shè)計，對pH值、蛋白與麥芽糊精比例、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度4個因素進行優(yōu)化，以接枝度為響應(yīng)指標，具體設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表2所示。

表2 設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Design and test results

2.5.2回歸方程的建立與方差分析

用Design-Expert8.0.6軟件對表2的結(jié)果進行多元回歸分析，得到接枝度（Y）和反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）、pH值（C）、蛋白與麥芽糊精比例（D）的編碼二次多項式回歸方程如下：

Y=25.57+1.32A+1.53B+0.77C+0.14D+0.57AB+0.13AC+0.03AD+0.10BC+0.66BD-0.76A2-0.74B2-0.19C2-0.49D2

對此方程進行F檢驗，發(fā)現(xiàn)模型擬合檢驗F1=23.36，P值＜0.000 1，表明模型擬合性較好，達到極顯著水平；同時失擬性檢驗，F(xiàn)2=0.63，P值=0.749＞0.05，說明模型失擬性檢驗不顯著，表明選取的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、pH值及蛋白-麥芽糊精比例四個因素對豌豆蛋白糖基化改性的接枝度都有影響，沒有可忽視的因子存在。R2=0.987 9，綜合表明此模型準確可用，且回歸方程具有實際價值。中心復(fù)合響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果見表3，二次回歸分析參數(shù)模型數(shù)據(jù)如表4所示。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of Variance（ANOVA）for the quadratic model

2.5.3 主效應(yīng)分析

從表3方差分析結(jié)果可以看出，模型中各項F值的大小能反映出四個因素對麥芽糊精糖基化豌豆蛋白接枝度的影響程度，其中由表可知反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時間（B）、pH 值（C）、蛋白與麥芽糊精比例（D）四個因素的系數(shù)絕對值分別為20.78、28.00、7.07和0.24，因此各試驗因素對麥芽糊精糖基化豌豆蛋白接枝度的影響主次順序為：B＞A＞C＞D。

2.5.4 雙因素交互效應(yīng)分析

由表3可知，交互項AB和BD的P值均小于0.05，說明反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間、反應(yīng)時間與蛋白麥芽糊精比例的交互作用顯著，其他交互項P值均大于0.05不顯著。交互項顯著的響應(yīng)面和等高線圖如5所示。

由圖5可知，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間（AB）的交互作用對接枝度的影響，當反應(yīng)溫度在[-1～0]、反應(yīng)時間比在[-1～0]區(qū)間內(nèi)豌豆蛋白糖基化接枝度隨著編碼值的增加而逐漸增加；當反應(yīng)溫度在[0～1]、反應(yīng)時間比在[0～1]區(qū)間內(nèi)，兩者的交互作用先增加后降低，說明達到一定值后兩者就會出現(xiàn)拮抗作用。反應(yīng)時間（B）和蛋白糖比例（D）之間的交互作用也如此。總之，通過圖5 AB和BD的相應(yīng)面變化情況可知，交互曲線的走勢越陡峭，說明交互項對接枝度的影響越顯著；響應(yīng)面曲線坡度越小，則其對接枝度的影響越小。據(jù)圖可知，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間（AB）響應(yīng)面有最高點，說明對豌豆蛋白糖基化接枝度的影響顯著[20]。

表4 二次回歸模型參數(shù)表Table 4 The parameters of quadratic regression

圖5 等高線及響應(yīng)面圖Fig.5 Diagram of contour and response surface

2.5.5驗證試驗

經(jīng)Design Expert10.03軟件給出的回歸分析最優(yōu)參數(shù)進行試驗驗證，回歸模型優(yōu)化分析得到的因素編碼值為反應(yīng)溫度（A）=0.897 216、反應(yīng)時間（B）=0.709 553、pH值=0.450 251、蛋白糖比例（D）=0.278 023，接枝度為27.81%。將其編碼值轉(zhuǎn)換為實際值為反應(yīng)溫度=79.48℃、反應(yīng)時間=77.09 min、pH值=8.22、蛋白糖比例=49.05%，考慮到回歸計算實際操作性，將前期轉(zhuǎn)化的參數(shù)值修正為反應(yīng)溫度（A）=80℃、反應(yīng)時間（B）=75 min、pH 值=8.2、蛋白糖比例（D）=50%（1∶1），按照以上修正的最優(yōu)工藝參數(shù)對豌豆蛋白進行糖基化處理。實際測定得到豌豆蛋白糖基化的接枝度為27.63%。實際值與理論預(yù)測值之間相對誤差在±10%之內(nèi)，差異很小，說明模型可以反應(yīng)麥芽糊精糖基化對豌豆蛋白的改性效果，并優(yōu)化參數(shù)穩(wěn)定、易于操作，可用于制備糖基化改性豌豆蛋白。

3 結(jié)論

通過單因素及Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化，確定了糖基化改性豌豆蛋白的最優(yōu)工藝參數(shù)為反應(yīng)溫度79.48℃、反應(yīng)時間77.09 min、pH值8.22、蛋白糖比例49.05%，在此優(yōu)化條件下豌豆蛋白糖基化的接枝度為27.81%，經(jīng)驗證模型預(yù)測值與實際值相差很小，表明可按此優(yōu)化工藝制備麥芽糊精糖基化改性豌豆蛋白。