施 珂,孫嘯濤,*,沈才洪,敖 靈,鄭福平,黃明泉,孫金沅,李賀賀

(1.北京工商大學(xué),北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048;2.瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州 646000)

白酒是中國(guó)的國(guó)酒,歷史底蘊(yùn)豐厚,香型種類繁多,而“瀘型酒”產(chǎn)量占我國(guó)白酒產(chǎn)量的70%以上[1]。泥窖發(fā)酵是瀘型酒的典型工藝,隨著發(fā)酵的過程大量的揮發(fā)性成分生成,賦予了酒體窖香濃郁、綿甜醇厚的風(fēng)格特征[2]。因此,對(duì)形成瀘型酒典型感官風(fēng)格的關(guān)鍵香氣成分的科學(xué)解構(gòu),可為酒企的品質(zhì)提升及酒體設(shè)計(jì)提供重要的科學(xué)依據(jù)。

迄今為止,瀘型酒的風(fēng)味研究已取得長(zhǎng)足發(fā)展,Fan等[3]從兩種濃香型酒中鑒定出126種風(fēng)味物質(zhì);孫金沅等[4]從濃香型酒醅中定性出148種揮發(fā)性香氣成分,結(jié)合香氣活性值(OAV)和香氣強(qiáng)度分析,將己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯等確定為重要香氣化合物;Zhao等[5]在瀘型酒中定量出60種風(fēng)味成分,其中35種OAVs≥1的化合物被確定為關(guān)鍵香氣物質(zhì),濃香型酒中豐富的香氣成分構(gòu)成了其獨(dú)特的風(fēng)味特征。

近年來,白酒風(fēng)味成分的提取方法多采用液液萃取[5-7]、同時(shí)蒸餾萃取[8-9]、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)[10]等。但上述方法存在操作繁瑣、有機(jī)試劑用量大等缺點(diǎn),因此,安全、便捷的無溶劑萃取技術(shù)得到了研究者的廣泛關(guān)注[11]。頂空固相微萃取(HS-SPME)和靜態(tài)頂空(SHS)可在一定程度上消減復(fù)雜樣品基質(zhì)對(duì)儀器的污染,進(jìn)而減小對(duì)目標(biāo)樣品檢測(cè)所造成的干擾[12]。Wang等[13]采用HS-SPME在稻花香白酒中提取出57種風(fēng)味物質(zhì);張建等[14]將SHS應(yīng)用于醬香型白酒揮發(fā)性香氣成分的研究。目前,將兩種方法對(duì)比應(yīng)用于瀘型酒風(fēng)味分析的研究未見報(bào)道。

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)是較為經(jīng)典的傳統(tǒng)食品風(fēng)味分析手段,此方法的研究常以追求化合物種類和含量多為片面指標(biāo)而不考慮食品體系整體感官的呈現(xiàn),因此,尋求一種反映白酒整體感官特征的分析方法是十分必要的。直接-氣相色譜-嗅聞法(D-GC-O)是在本世紀(jì)初興起的風(fēng)味評(píng)價(jià)新手段,其通過將提取物注射到一個(gè)與GC進(jìn)樣口和嗅聞儀相連的、空的色譜柱中,感官人員直接嗅聞未經(jīng)色譜柱分離的香氣萃取物,結(jié)合感官評(píng)價(jià)考察萃取物與真實(shí)樣品的整體風(fēng)味相似度,進(jìn)而確定最佳萃取條件。該方法首次報(bào)道于2002年,Lecanu等[15]通過優(yōu)化HS-SPME將D-GC-O用于表面催熟干酪氣味分析的研究;Rega等[16]正式提出D-GC-O的概念,并應(yīng)用于橙汁風(fēng)味的研究。之后,此方法還被用于醬油等食品體系的整體風(fēng)味的評(píng)價(jià)[17-23],D-GC-O避免了色譜分離的選擇性,能夠反映萃取物的整體風(fēng)味特性。Sha等[24]首次采用該方法對(duì)白酒中含硫化合物進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,D-GC-O法篩選的最優(yōu)萃取條件所得到的萃取物與原始酒樣相比具有更高的風(fēng)味相似度。但目前,尚未見無溶劑萃取結(jié)合D-GC-O應(yīng)用于瀘型酒研究的報(bào)道。

本研究以瀘州老窖原漿酒為研究對(duì)象,采用HS-SPME/SHS-D-GC-O結(jié)合GC-MS技術(shù),從整體感官和風(fēng)味物質(zhì)分析角度考察最優(yōu)萃取條件,在此條件下對(duì)瀘型酒揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定量分析,利用氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(GC-O-MS)確定瀘型酒中揮發(fā)性成分的香氣強(qiáng)度,并結(jié)合OAV分析對(duì)瀘型酒整體香氣有重要貢獻(xiàn)的化合物,明確瀘香型白酒中的關(guān)鍵香氣成分,以期構(gòu)建適合瀘型白酒分析的新方法體系,為濃香型白酒企業(yè)的風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒樣 瀘州老窖2015年份原漿酒(68% vol,500 mL),以下圖表中簡(jiǎn)稱LZ原酒;無水乙醇(色譜純) 北京伊諾凱科技有限公司;氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;C6～C30正構(gòu)烷烴(色譜純) 百靈威科技有限公司;高純氮?dú)?、高純氦?北京北氧利來科技發(fā)展有限公司;香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品 供應(yīng)商如表1中字母所示,a.北京伊諾凱科技有限公司,b.北京百靈威科技有限公司,c.北京華威銳科化工有限公司,d.上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司,所有試劑均為色譜純,純度不低于97%。

表1 瀘型酒揮發(fā)性香氣成分檢測(cè)分析結(jié)果Table 1 Analysis of volatile aroma components in Luzhou-flavour baijiu

續(xù)表

續(xù)表

BL-2200H電子分析天平 島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市予華儀器有限公司;Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司;進(jìn)樣瓶(2 mL)、頂空進(jìn)樣針(25 μL～2.5 mL)、7890 GC、7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司;ODP C200 嗅聞儀 德國(guó)Gerstel公司;Trace 1300-ISQ GC-MS聯(lián)用儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司;Kylin-Bell渦旋混合器 其林貝爾儀器制造有限公司;頂空進(jìn)樣瓶(20 mL) 中國(guó)安普公司;萃取纖維頭65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HS-SPME法提取瀘香型白酒香氣成分 將原酒樣稀釋至酒精含量為15%vol,準(zhǔn)確量取8 mL稀釋后的酒樣置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中[25],加入一定量的NaCl、10 μL內(nèi)標(biāo)液(乙酸戊酯、4-辛醇和2-乙基丁酸,最終濃度:20 mg/L)將頂空進(jìn)樣瓶密封,在一定溫度下平衡一段時(shí)間,將老化好的萃取頭插入頂空瓶中,恒溫萃取一定的時(shí)間,萃取完畢后取出纖維頭,插入GC進(jìn)樣口,解吸5 min,解吸溫度250 ℃,進(jìn)行儀器分析。

單因素實(shí)驗(yàn):采用控制變量法,依次優(yōu)化萃取頭(65 μm PDMS/DVB、100 μm PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS)、萃取溫度(15、25、35、45、55 ℃)、萃取時(shí)間(20、30、40、50、60 min)、平衡時(shí)間(0、5、10、15、20 min)和加鹽量(0、1、2、3 g NaCl)5個(gè)影響因素,以D-GC-O感官評(píng)價(jià)所得的風(fēng)味強(qiáng)度、相似度、各個(gè)香氣分支評(píng)分及不同萃取條件下GC-MS所得香氣成分?jǐn)?shù)量為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),考察某一單因素時(shí),HS-SPME的其他實(shí)驗(yàn)條件為:采用75 μm CAR/PDMS萃取頭,將酒樣加NaCl至過飽和(3 g),在45 ℃下平衡15 min,恒溫萃取40 min,上述均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SHS法提取瀘香型白酒香氣成分 準(zhǔn)確量取8 mL稀釋至15% vol的酒樣置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中,加NaCl飽和,置于45 ℃水浴鍋中平衡15 min,抽取頂空氣體2 mL,進(jìn)行儀器分析[26]。

1.2.3 D-GC-O法測(cè)定瀘香型白酒整體風(fēng)味

1.2.3.1 D-GC-O條件 柱溫箱保持在40 ℃,載氣:N2(99.9%),流速2.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,選用不分流模式,萃取頭在進(jìn)樣口解吸5 min;兩次進(jìn)樣之間,將柱溫升到250 ℃,保持5 min,以防止樣品交叉污染;采用一根無填料的毛細(xì)色譜柱(100 cm×0.25 mm)連接進(jìn)樣口與嗅聞儀,感官人員可直接在嗅聞端口評(píng)價(jià)未經(jīng)色譜柱分離的揮發(fā)性萃取物的整體風(fēng)味強(qiáng)度和風(fēng)味特征[23],具體的感官評(píng)價(jià)方法如1.2.3.2所示。

1.2.3.2 感官評(píng)價(jià) 感官品評(píng)小組由8名嗅味覺靈敏、訓(xùn)練有素的評(píng)酒人員組成。取8 mL酒樣于白酒品評(píng)專用杯中,在室溫為(20±1) ℃條件下對(duì)瀘型酒的八種特征性風(fēng)味進(jìn)行評(píng)分,參考七種標(biāo)準(zhǔn)品溶液和一種混合物的香氣對(duì)原酒樣打分,己酸乙酯(果香)、戊酸乙酯(甜香)、苯乙酸乙酯(花香)、1-丁醇(醇味)、丁酸(酸味)、正辛醇(青草香)、蒸煮糧食(糧香)、對(duì)甲基苯酚(窖香)[5]。評(píng)分范圍為0～5分,0為未聞到,5為聞到的香氣最強(qiáng),在不同萃取條件下,嗅聞?dòng)蒁-GC-O流出的未經(jīng)色譜分離的香氣萃取物,對(duì)比真實(shí)酒樣的風(fēng)味特征進(jìn)行打分。在實(shí)驗(yàn)過程中,品評(píng)小組成員需要對(duì)D-GC-O樣品進(jìn)行三方面的評(píng)價(jià):提取物的風(fēng)味強(qiáng)度;提取物的風(fēng)味與原樣品的相似程度;對(duì)提取物八個(gè)香氣分支的評(píng)分。窖香分支作為瀘型酒的特征風(fēng)味,將作為優(yōu)化條件的重要參考。感官評(píng)價(jià)人員在兩次D-GC-O實(shí)驗(yàn)的間隙要再次嗅聞參照樣品,以增強(qiáng)他們對(duì)真實(shí)酒樣整體香氣的印象,不同萃取條件下每人嗅聞三次,取所有成員打分均值作風(fēng)味雷達(dá)圖。

1.2.4 瀘香型白酒香氣成分的測(cè)定

1.2.4.1 GC-MS條件 GC條件:色譜柱:DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃,以10 ℃/min升至50 ℃,保持5.5 min,以 3 ℃/min升至80 ℃,保持8 min,再以5 ℃/min升至245 ℃,保持3 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣:He(99.999%);恒流:1.0 mL/min;分流比:10∶1。

MS條件:電子電離源(electron ionization,EI);電子能量70 eV;離子源溫度250 ℃;四極桿溫度150 ℃;傳輸管線溫度240 ℃;無溶劑延遲;掃描模式為全掃描;掃描質(zhì)量范圍m/z 35～450;駐留時(shí)間0.2 s。

1.2.4.2 GC-O-MS條件 GC-O-MS系統(tǒng)由氣相色譜-質(zhì)譜及嗅聞裝置組成。色譜柱:DB-Wax柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);GC和MS條件同1.2.4.1,載氣流速:1.5 mL/min,分流比:10∶1;嗅聞儀傳輸線溫度250 ℃。選擇6位有豐富經(jīng)驗(yàn)的感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行聞香分析,每人重復(fù)嗅聞兩次,記錄所嗅聞到流出物的保留時(shí)間、香氣強(qiáng)度和香氣描述[4],取某化合物被描述頻率較高的1～3個(gè)詞為其香氣特征,采用4刻度法記錄強(qiáng)度:0-極弱,1-較弱,2-中等,3-較強(qiáng),4-最強(qiáng),化合物被半數(shù)以上評(píng)價(jià)員嗅聞到才能被確定為風(fēng)味活性物質(zhì),以重復(fù)描述率最高的級(jí)別作為最終香氣強(qiáng)度值。

1.2.5 定性及定量分析 定性:GC-MS所檢測(cè)化合物的定性通過質(zhì)譜解析與NIST 11譜庫(kù)檢索、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)、保留指數(shù)(retention index,RI)比對(duì),GC-O-MS所檢測(cè)化合物的定性還需與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物香氣特征進(jìn)行對(duì)比。保留指數(shù)的計(jì)算公式:RI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn),其中,tx為分析組分在氣相色譜中的保留時(shí)間,tn和tn+1是碳原子數(shù)為n和n+1正構(gòu)烷烴出峰的保留時(shí)間。

內(nèi)標(biāo)法定量:用15%的乙醇水溶液將化合物標(biāo)準(zhǔn)品配成高濃度的混合儲(chǔ)備液,稀釋成一系列梯度,取8 mL各梯度混標(biāo)液于頂空瓶中,并加入與酒樣一致的內(nèi)標(biāo),在最優(yōu)條件下進(jìn)行萃取與分析,采用選擇離子掃描法(SIM)測(cè)定化合物的峰面積,以待測(cè)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo),峰面積之比為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系通過線性決定系數(shù)(R2)進(jìn)行評(píng)估,將信噪比大于3時(shí)的質(zhì)量濃度確定為檢出限(LOD),以三次平行實(shí)驗(yàn)所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)對(duì)精密度進(jìn)行評(píng)估。

1.2.6 關(guān)鍵香氣成分的確定 采用香氣活性值(OAV)表征瀘型酒中香氣成分對(duì)整體風(fēng)味的貢獻(xiàn),OAV=香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度/閾值,香氣化合物的OAV值越大,說明其對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)越大,當(dāng)OAV大于1時(shí),可認(rèn)為該化合物對(duì)白酒香氣有較大貢獻(xiàn)[27],結(jié)合GC-O-MS所得香氣強(qiáng)度值綜合分析,將香氣強(qiáng)度評(píng)分不小于3且OAV大于10的化合物確定為瀘型酒中的關(guān)鍵香氣成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

按照1.2方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對(duì)不同萃取條件下的總離子流色譜圖進(jìn)行解析,對(duì)比分析化合物數(shù)量,并統(tǒng)計(jì)感官評(píng)價(jià)打分?jǐn)?shù)據(jù),1.2.5部分實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),通過Agilent Masshunter B.07.00軟件對(duì)MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,酒樣中化合物定量結(jié)果以平均值表示,柱形圖用OriginPro 8.5軟件繪制,采用Microsoft Office Excel 2016對(duì)不同萃取條件下香氣強(qiáng)度與相似度評(píng)分結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析、繪制風(fēng)味輪圖并進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME條件優(yōu)化

2.1.1 萃取頭對(duì)香氣成分萃取效果的影響 實(shí)驗(yàn)考察了4種萃取頭對(duì)瀘州老窖原酒中揮發(fā)性化合物的萃取效果。由圖1A可知,萃取物的整體香氣強(qiáng)度和相似度的排序?yàn)?CAR/PDMS> DVB/CAR/PDMS> PDMS/DVB> PDMS;香氣強(qiáng)度和相似度的評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)經(jīng)顯著性方差分析,均為P<0.05,可認(rèn)為4種萃取頭差異顯著。圖2A所示為不同萃取頭所吸附的萃取物與原酒樣品的香氣得分對(duì)比雷達(dá)圖,CAR/PDMS萃取的香氣化合物整體風(fēng)味輪廓最接近原酒樣,且窖香風(fēng)味相較于其他萃取頭更為突出。此外,含DVB涂層的萃取頭(CAR/DVB/PDMS和PDMS/DVB)可聞到一種令人不快的藥味,這是引起其氣味相似度低的主要原因,有報(bào)道表明,可能與DVB涂層吸附大量高分子的芳香環(huán)和雜環(huán)化合物有一定關(guān)系[23]。由GC-MS檢測(cè)到的化合物數(shù)量表明:CAR/PDMS(91種)=DVB/CAR/PDMS(91種)> PDMS/DVB(79種)>PDMS(74種),因此,不論是從儀器檢測(cè)還是感官特征的分析角度,CAR/PDMS萃取頭對(duì)原酒風(fēng)味化合物的萃取效果都為最佳。

圖1 不同萃取條件對(duì)萃取物的感官?gòu)?qiáng)度和相似度的影響Fig.1 Effect of different extraction conditions on sensory intensity and similarity of extracts注:A:萃取頭;B:萃取溫度;C:萃取時(shí)間;D:平衡時(shí)間;E:加鹽量;F:HS-SPME與SHS對(duì)比；圖2同。

2.1.2 萃取溫度對(duì)香氣成分萃取效果的影響 實(shí)驗(yàn)考察了不同萃取溫度對(duì)SPME萃取效果的影響。由圖1B可知,隨萃取溫度的升高,D-GC-O嗅聞到萃取物的香氣強(qiáng)度評(píng)分值也逐漸升高,45 ℃時(shí)其整體風(fēng)味與原酒樣相似度最高,繼續(xù)升溫相似度下降,可能原因?yàn)?溫度較高有利于酒樣中揮發(fā)性成分散發(fā)到頂空中,提高吸附效率,但高溫在加速一些揮發(fā)物釋放的同時(shí),會(huì)降低萃取頭的吸附能力[28],經(jīng)顯著性方差分析,香氣強(qiáng)度和相似度的評(píng)分結(jié)果均為P<0.05,可認(rèn)為5種溫度差異顯著。由圖2B可見,各個(gè)香氣分支的評(píng)分在45 ℃時(shí)更為接近真實(shí)酒樣,且窖香風(fēng)味突出。經(jīng)GC-MS檢測(cè)不同萃取溫度下化合物數(shù)量為45 ℃(87種)>35 ℃(85種)>55 ℃(82種)>25 ℃(78種)>15 ℃(77種),進(jìn)一步驗(yàn)證了D-GC-O感官評(píng)價(jià)的結(jié)果。因此,45 ℃是最適宜的萃取溫度。

圖2 不同萃取條件下白酒萃取物的感官特征輪廓Fig.2 Odour sensory profiles of extracts in Baijiu under different extraction conditions

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)香氣成分萃取效果的影響 實(shí)驗(yàn)考察了不同萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響。由圖1C可知,香氣強(qiáng)度隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,相似度呈先增后減趨勢(shì),在40 min時(shí)達(dá)到最大,香氣強(qiáng)度和相似度的評(píng)分結(jié)果經(jīng)顯著性方差分析,均為P<0.05,可認(rèn)為5種萃取時(shí)間差異顯著。研究表明,萃取纖維對(duì)酒樣中的香氣成分吸附量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加,但達(dá)到某一時(shí)刻后上述吸附量達(dá)到飽和;若增長(zhǎng)萃取時(shí)間,揮發(fā)性相對(duì)較弱物質(zhì)的吸附濃度會(huì)因相對(duì)較強(qiáng)物質(zhì)的濃度增加而降低,致使總峰個(gè)數(shù)下降[29],這也解釋了GC-MS的檢測(cè)結(jié)果:40 min(89種)>30 min(84種)>50 min(80種)>60 min(79種)>20 min(78種),在萃取40 min時(shí)化合物種類最多。不同萃取時(shí)間下各個(gè)香氣分支的評(píng)分如圖2C,可見短時(shí)間萃取時(shí),甜香明顯減弱,而過長(zhǎng)時(shí)間的萃取使青草香味增強(qiáng),在40 min時(shí)窖香味接近原酒且整體輪廓與真實(shí)酒樣更相似。綜合考慮,40 min的萃取時(shí)間為最優(yōu)萃取時(shí)間。

2.1.4 平衡時(shí)間對(duì)香氣成分萃取效果的影響 實(shí)驗(yàn)考察了不同平衡時(shí)間對(duì)SPME萃取原酒中揮發(fā)性化合物的影響。由圖1D可知,隨著平衡時(shí)間的增長(zhǎng),香氣強(qiáng)度遞增,在15 min后基本保持不變,且相似度在15 min時(shí)達(dá)到最高值,經(jīng)顯著性方差分析,香氣強(qiáng)度和相似度的評(píng)分結(jié)果均為P<0.05,可認(rèn)為5個(gè)平衡時(shí)間下香氣強(qiáng)度和相似度的差異顯著。由圖2D可知,平衡15 min時(shí),香氣輪廓趨于原酒樣,且窖香分支突出。GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明:15 min(91種)>20 min(90種)>10 min(88種)>5 min(87種)>不平衡(85種),故選擇15 min為最佳平衡時(shí)間。

2.1.5 加鹽量對(duì)香氣成分萃取效果的影響 實(shí)驗(yàn)考察了不同加鹽量對(duì)SPME萃取原酒中揮發(fā)性化合物的影響。如圖1E,隨著酒樣加入NaCl質(zhì)量的增加,香氣強(qiáng)度和相似度的評(píng)分均呈增大趨勢(shì),加鹽至3 g(過飽和)時(shí)達(dá)到最大,二者的評(píng)分結(jié)果經(jīng)顯著性方差分析,均為P<0.05,可認(rèn)為4種加鹽量下香氣強(qiáng)度和相似度的差異顯著。由圖2E可見,各香氣分支的輪廓隨加鹽量的增加逐漸趨于真實(shí)酒樣,在加鹽至3 g時(shí)最接近真實(shí)酒樣,且窖香風(fēng)味明顯。由GC-MS檢測(cè)風(fēng)味化合物數(shù)量表明:3 g(91種)>2 g(88種)>1 g(87種)>不加鹽(82種),進(jìn)一步驗(yàn)證了D-GC-O嗅聞所選擇的優(yōu)化值。因此將加鹽量確定為3 g較為合適。

2.2 HS-SPME與SHS對(duì)比

圖1F和圖2F所示為HS-SPME與SHS對(duì)瀘型酒中揮發(fā)性化合物的萃取效果,D-GC-O嗅聞結(jié)果顯示:HS-SPME的相似度和強(qiáng)度均高于SHS,香氣強(qiáng)度和相似度的評(píng)分結(jié)果經(jīng)顯著性方差分析,均為P<0.05,兩種萃取方法差異顯著,且HS-SPME的香氣輪廓更接近真實(shí)酒樣,這一結(jié)果也較好地契合了D-GC-O相關(guān)報(bào)道中將兩種方法對(duì)比應(yīng)用于樣品風(fēng)味成分提取的研究結(jié)果[16,21]。

如圖3所示,經(jīng)GC-MS鑒定,HS-SPME共檢出91種揮發(fā)性成分,其中酯類44種,芳香類12種,酸類10種,醇類9種,呋喃醛酮12種,含硫類3種,烷烴1種;SHS共檢出60種揮發(fā)性成分,其中酯類37種,芳香類6種,酸類3種,醇類8種,呋喃醛酮6種。結(jié)果表明:無論是風(fēng)味物質(zhì)的總量還是各類化合物的總數(shù),HS-SPME都多于SHS,大多數(shù)為酯類和醇類化合物,且數(shù)據(jù)分析表明SHS所檢出的成分都包含在HS-SPME中。這是由于HS-SPME纖維頭對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)有一定的吸附富集作用,而SHS是一種非富集型的氣體分析方法,對(duì)某些在頂空中含量極微成分提取檢測(cè)的靈敏度較低[12]。綜上,相比于SHS,SPME法更適用于本實(shí)驗(yàn)酒樣揮發(fā)性成分的提取分析。

圖3 兩種分析方法提取香氣成分比較Fig.3 Comparison of aroma components extracted by two methods

2.3 瀘香型白酒揮發(fā)性成分的香氣強(qiáng)度和特征分析

采用上述實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)條件提取瀘型酒中的香氣物質(zhì),經(jīng)GC-O-MS嗅聞分析,對(duì)所識(shí)別出的香氣區(qū)域進(jìn)行質(zhì)譜碎片、保留指數(shù)以及香氣特征比對(duì),共準(zhǔn)確定性出91種揮發(fā)性香氣成分,結(jié)果如表1所示,包括酯類44種、醇類9種、酸10種、芳香類12種、呋喃醛酮12種、含硫類3種和其他類1種。嗅聞結(jié)果表明:其中46種組分具有明顯的香氣特征,包括酯類22種,醇類7種,酸類4種,芳香類7種,呋喃醛酮類5種,含硫類1種。酯類化合物不僅香氣物質(zhì)種類多,而且香氣強(qiáng)度值較高,以己酸乙酯為代表的乙酯類化合物賦予白酒花果香和甜香;酸類化合物是白酒中的協(xié)調(diào)成分,瀘型酒中丁酸、戊酸和己酸表現(xiàn)出較高的香氣強(qiáng)度,有研究報(bào)道異戊酸和己酸對(duì)白酒中的奶酪香氣有貢獻(xiàn)[30],酸類也是產(chǎn)生窖香的主要成分之一[31],這與實(shí)驗(yàn)中丁酸等成分呈現(xiàn)出明顯的酸臭味相一致;醇類物質(zhì)能夠柔和白酒的香氣,大多呈現(xiàn)醇香和青草味,有報(bào)道表明2-庚醇對(duì)白酒中的果香香氣有貢獻(xiàn)[3],本實(shí)驗(yàn)嗅聞結(jié)果與此相符;醛酮類也是瀘型酒中重要的風(fēng)味組分,其中3-甲基丁醛和2-辛酮具有較高的香氣強(qiáng)度,糠醛呈現(xiàn)杏仁味、烤味,這些化合物的存在極大的豐富了瀘型酒的香氣層次;芳香類化合物在嗅聞中多表現(xiàn)為花香和蜂蜜香,如苯乙醛、苯乙酸乙酯和苯丙酸乙酯,這些物質(zhì)所呈現(xiàn)的香氣可能與苯丙氨酸的代謝相關(guān)[32],對(duì)甲基苯酚則表現(xiàn)為濃郁的馬廄臭味,有研究表明,對(duì)甲基苯酚是是瀘型酒中呈現(xiàn)窖香風(fēng)味的特征香氣成分[33]。此外,3-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基三硫、苯乙酸乙酯等化合物香氣強(qiáng)度值均為4,可能對(duì)瀘型酒整體風(fēng)味的影響較為明顯。

2.4 瀘香型白酒揮發(fā)性成分定量分析

2.4.1 定量方法評(píng)估 采用HS-SPME結(jié)合GC-MS對(duì)瀘型酒中的77種香氣成分進(jìn)行定量,結(jié)果見表2,包括酯類38種、酸類9種、醇類11種、芳香類8種、呋喃醛酮7種、含硫類1種和其他類3種。所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上,線性關(guān)系良好,檢出限為0.06～158.63 μg/L,方法靈敏度較高,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%,精密度較高,該方法能夠滿足瀘型酒中揮發(fā)性成分的定量要求。

2.4.2 定量結(jié)果分析 由表2可知,瀘型酒中的酯類化合物種類豐富且含量較高,是白酒香氣成分的主體,占香氣物質(zhì)總量的85.86%,其中己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯和辛酸乙酯等乙酯類化合物含量具有明顯優(yōu)勢(shì),這是由于原漿酒中乙醇含量較高,在發(fā)酵和陳釀過程中生成大量乙酯類化合物[4]。瀘型酒中酸類物質(zhì)含量?jī)H次于酯類,占香氣物質(zhì)總量的7.69%,其中己酸和丁酸具有較高的濃度水平,酸類化合物是酯類的前驅(qū)物質(zhì),主要由發(fā)酵過程微生物與有機(jī)物發(fā)生生化反應(yīng)所產(chǎn)生[34-35]。醇類物質(zhì)也是瀘型酒呈味助香劑的主要來源,含量較高有異丁醇、2-戊醇和己醇等,白酒中的高級(jí)醇一般由發(fā)酵過程中氨基酸的降解和葡萄糖經(jīng)EMP途徑的轉(zhuǎn)化而生成[27]。瀘型酒酒中鑒定出的呋喃醛酮類化合物含量較少,推測(cè)是由于該類物質(zhì)性質(zhì)較活潑,屬于不穩(wěn)定的中間體化合物,在揮發(fā)性成分萃取的過程中易被還原成相應(yīng)的酸或醇[36],其中3-甲基丁醛和糠醛含量較高,有研究表明,糠醛主要產(chǎn)生于蒸餾過程中,呈現(xiàn)甜香和杏仁香[37]。芳香族化合物中苯乙酸乙酯含量較高,該類物質(zhì)主要來源于氨基酸的生物分解[34]。此外,在瀘型酒中所檢出的1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷具有較高的濃度。

2.4.3 揮發(fā)性香氣成分的OAV分析 瀘型酒中香氣化合物的含量并不能說明其對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)的大小,化合物的香氣閾值也是需考慮的因素之一,香氣活性值的引入成為衡量某種香氣物質(zhì)對(duì)整體香氣貢獻(xiàn)度大小的重要指標(biāo)[30,38]。根據(jù)定量結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的風(fēng)味成分閾值計(jì)算得到的70種化合物的OAV值,如表2所示,瀘型酒中有34種具有香氣貢獻(xiàn)的化合物(OAV>1),包括醇類15種,酸類和醇類各5種,芳香類和呋喃醛酮類各4種,含硫類和其他類各1種。其中,OAV>1000的化合物有6種,分別為:己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、異丁酸乙酯和3-甲基丁醛,這些物質(zhì)對(duì)瀘型酒的整體風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)。己酸乙酯的OAV最高,符合國(guó)標(biāo)中對(duì)濃香型白酒具有以己酸乙酯為主體的復(fù)合香氣的描述[31];其次為辛酸乙酯(OAV=11968.78),有研究表明辛酸乙酯含量較傳統(tǒng)的四大酯低,但其香氣強(qiáng)度貢獻(xiàn)比丁酸乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯都大,而僅次于己酸乙酯[39],本實(shí)驗(yàn)OAV結(jié)果較好的驗(yàn)證了這一觀點(diǎn);3-甲基丁醛(OAV=1037.62)在前期嗅聞中呈現(xiàn)青草和麥芽香,也是瀘型酒中的重要風(fēng)味成分,2-甲基丙醛(OAV=460.03和2-甲基丁醛(OAV=150.57)含量雖然不高,但因其閾值較低,所以對(duì)整體香氣具有較大貢獻(xiàn);相反,醇類和酸類物質(zhì)固然含量較多,但普遍具有較高的閾值,使其OAV值呈現(xiàn)較低的水平,OAV>10的僅有己酸、丁酸、戊酸和1-丁醇;芳香族化合物含量相對(duì)較低,僅有苯丙酸乙酯、苯乙酸乙酯和對(duì)甲基苯酚的OAV>1;此外,痕量的二甲基三硫(OAV=91.75)因閾值較低,依然對(duì)瀘型酒的整體香氣有一定的貢獻(xiàn)。

表2 瀘型酒揮發(fā)性香氣成分定量結(jié)果及OAV值Table 2 Quantitative results of volatile aroma components of Luzhou-flavour Baijiu and OAVs

續(xù)表

2.5 關(guān)鍵香氣成分的確定

根據(jù)瀘型酒揮發(fā)性成分的香氣強(qiáng)度值判定和OAV分析可知,兩者在結(jié)果上具有一定的相似性,己酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸、3-甲基丁醛等OAV和香氣強(qiáng)度值都比較高,說明它們是瀘型酒的重要香氣成分,且己酸乙酯、辛酸乙酯和戊酸乙酯表現(xiàn)為花果香和甜香,己酸呈酸味,3-甲基丁醛具有青草香,這些均構(gòu)成了瀘型酒的特征香氣。此外,兩種方法的分析結(jié)果也存在一定的差異,如己酸丁酯、2-甲基丙醛的OAV>1,但其香氣強(qiáng)度值卻不高甚至未被嗅聞到香氣特征,癸酸乙酯的香氣強(qiáng)度值較高,但OAV值并不高;已有報(bào)道出現(xiàn)過類似現(xiàn)象[40],其原因可能是香氣物質(zhì)之間存在著協(xié)同與拮抗作用,部分化合物采用在水中的閾值與其在白酒體系中的閾值有一定偏差,某些OAV<1的化合物因香氣物質(zhì)間的協(xié)同作用而能被嗅聞到[32]。分析認(rèn)為瀘型酒的關(guān)鍵香氣成分應(yīng)具備以下條件:該化合物的香氣強(qiáng)度值不小于3且OAV值大于10,所呈現(xiàn)出的香氣特征與瀘型酒的風(fēng)格接近,表現(xiàn)為花香、果香、甜香、酸香、青草香、醇香、窖香等。綜合考慮,將瀘型酒中18種化合物確定為關(guān)鍵香氣成分,分別為:乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、異己酸乙酯、己酸乙酯、丁酸異戊酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁酸、戊酸、己酸、1-丁醇、3-甲基丁醛、2-辛酮、二甲基三硫,這些化合物對(duì)瀘型酒整體香氣特征具有重要貢獻(xiàn),香氣強(qiáng)度評(píng)分值也較高,因此推測(cè)這些香氣物質(zhì)是構(gòu)成瀘型酒整體香氣特征的關(guān)鍵成分。

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS結(jié)合D-GC-O分析比較了HS-SPME和SHS兩種無溶劑萃取的前處理方法對(duì)瀘香型白酒中揮發(fā)性化合物的提取效果,綜合考慮感官和儀器分析結(jié)果,得到的最佳萃取條件為:75 μm CAR/PDMS萃取頭、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間40 min、平衡時(shí)間15 min、加入NaCl至過飽和(3 g);在此條件下,對(duì)瀘型酒中77種揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了定量分析,由GC-O-MS確定了46種可被嗅聞到香氣組分,結(jié)合化合物的香氣強(qiáng)度值和OAV分析,共同鑒定出瀘型酒中18種關(guān)鍵香氣物質(zhì)為:乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、異己酸乙酯、己酸乙酯、丁酸異戊酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁酸、戊酸、己酸、1-丁醇、3-甲基丁醛、2-辛酮、二甲基三硫。本研究首次在瀘香型白酒中建立了HS-SPME/D-GC-O的分析方法,D-GC-O技術(shù)為科學(xué)解釋白酒釀造過程中各階段酒樣整體風(fēng)味特征提供了技術(shù)支持和理論依據(jù),未來可將其應(yīng)用于白酒領(lǐng)域多種品牌香型酒樣的風(fēng)味研究中。