朱亞男,徐菘陽(yáng),丁慧敏,陶明煊

(南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 210046)

人體內(nèi)有免疫器官、免疫細(xì)胞等,它們可以防護(hù)外界侵害,保護(hù)人體健康。這些免疫結(jié)構(gòu)能夠有效地提高免疫細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌抗體以及激活補(bǔ)體細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[1]。多糖在免疫調(diào)節(jié)上的作用主要是2個(gè)方面,非特異性免疫和特異性免疫。其中特異性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫。

多糖又稱多聚糖,是一類廣泛存在于動(dòng)植物與微生物體內(nèi)的生物信息大分子。對(duì)多糖的相關(guān)研究已有近70年的歷史,尤其是近些年,糖生物學(xué)成為了繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的又一大研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)[2]。已有研究表明,多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗發(fā)炎、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生物活性,其中免疫調(diào)節(jié)作用是多糖類物質(zhì)最重要的作用之一[3]。Ren等[4]從鮑魚菇Pleurotusabalonus子實(shí)體中分離出多糖PAP,在體外具有較高的抗氧化活性,對(duì)LoVo癌細(xì)胞具有劑量依賴性的抗增殖作用。Zhang等[5]從金福菇Tricholomalobayense中得到多糖TLH-3,能顯著提高小鼠的吞噬能力,釋放NO,分泌細(xì)胞因子TNF,可能通過(guò)TLR-4激活I(lǐng)B-NF-B途徑刺激巨噬細(xì)胞。我國(guó)在食用菌多糖的研究及開發(fā)利用方面近年來(lái)也取得很多成果,靈芝多糖、香菇多糖等食用菌多糖產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)分析鑒定投放市場(chǎng),經(jīng)過(guò)深加工的多糖保健品也相繼出現(xiàn)。雖然食用菌多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究較多,但研究不夠深入,比如有關(guān)食用菌多糖構(gòu)效關(guān)系研究較少。

白玉菇是一種常見(jiàn)的食用菌,其味道鮮美、富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等眾多營(yíng)養(yǎng)成分且價(jià)格低廉,具有廣闊的開發(fā)空間。有關(guān)白玉菇多糖對(duì)免疫抑制型小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以白玉菇精多糖(RPHM)為原料,通過(guò)建立環(huán)磷酰胺免疫抑制型小鼠模型,研究白玉菇精多糖對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)、造血功能、細(xì)胞因子含量、免疫器官組織形態(tài)和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能等的影響,綜合分析白玉菇精多糖的免疫調(diào)節(jié)活性,旨在為天然藥物或保健食品的研制、開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白玉菇子實(shí)體傘菌目、口蘑科、白蘑屬 于南京市蘇州路菜場(chǎng)購(gòu)買;甲醛(AR)、無(wú)水乙醇(AR)、伊紅Y(BS)、碳酸鈉(AR)、冰醋酸(AR) 南京化學(xué)試劑股份有限公司;中性樹脂(FMP) 中國(guó)上海標(biāo)本模型廠;注射用環(huán)磷酰胺 江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司;氯化鈉(AR) 南京化學(xué)試劑股份有限公司;陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖純品、印度墨汁(BS) 上海源葉生物科技有限公司;ICR健康小鼠(6周齡雄性) 78只,體重(25±3) g,購(gòu)于江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室,并于江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)(SYXK(蘇)2012-0047),先適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d,再造模并飼養(yǎng)15 d,動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室溫度為(25±3) ℃,濕度為60%±5%,每天照明12 h,喂以小鼠全價(jià)顆粒飼料并自由飲水。

JA5003N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;Centrifuge 5424 R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;754紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;BioTek ELX80酶標(biāo)儀 上海東風(fēng)電訊儀器廠;722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DHG-9140電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YD-6L型全自動(dòng)生物組織包埋機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠;YD-6L冷凍工作臺(tái) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠;LEICA RM2135石蠟切片機(jī) 德國(guó)Leica公司;YD-A型攤片機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠;YD-B烤片機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白玉菇子實(shí)體預(yù)處理 參考王美菊[6]去除雜質(zhì)后于60 ℃烘箱烘干至恒重,粉碎,過(guò)80目篩,得白玉菇細(xì)粉,放于干燥器中貯存?zhèn)溆?。?xì)粉冰水浴中經(jīng)超聲波破碎(600 W)、85 ℃熱水浸提、6000 r/min離心10 min、取上清濃縮、4倍體積乙醇沉淀、低溫干燥等步驟后,得到粗多糖。取粗多糖溶液4 mL,與預(yù)先配制成體積比為4∶1混合液的氯仿-正丁醇溶液1 mL混合,置于具塞試管中,充分振搖30 min后,經(jīng)離心機(jī)4000 r/min 4 ℃離心15 min,然后將水相與氯仿相分開。將水相再加入相當(dāng)于其體積1/4的氯仿-正丁醇溶液,重復(fù)上述過(guò)程,共計(jì)重復(fù)三次(Sevage法脫蛋白)。脫蛋白后透析一晝夜、乙醇沉淀、-80 ℃冷凍干燥后得白玉菇精多糖(RPHM),經(jīng)測(cè)定多糖含量為89.44%,蛋白含量為3.54%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 將78只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及白玉菇精多糖低、中、高劑量組共6組,每組13只,各組小鼠給藥品種和藥量如表1所示。注射用環(huán)磷酰胺須使用生理鹽水配制成適當(dāng)濃度,陽(yáng)性對(duì)照組灌胃用香菇多糖(LNT)[7]及各劑量組灌胃用白玉菇精多糖均使用蒸餾水配制成適當(dāng)濃度。1～3 d腹腔注射(分三次注射)與灌胃均在每一天上午同一時(shí)段進(jìn)行,4～14 d只需灌胃。

表1 動(dòng)物分組、給藥品種及給藥量Table 1 Animal grouping,drug delivery and dosage

1.2.3 小鼠一般狀況的觀察 適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d后,除空白對(duì)照組,其他5組小鼠均按照70 mg/kg bw的劑量進(jìn)行腹腔注射環(huán)磷酰胺,連續(xù)注射3 d,建立免疫抑制小鼠模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,對(duì)小鼠的體毛光澤順滑程度、體重變化情況、精神狀態(tài)、行為、進(jìn)針處狀況等基本情況進(jìn)行觀察并記錄。

1.2.4 體重及臟器指數(shù)測(cè)定 末次給藥24 h后(第15 d),小鼠稱重后頸椎脫臼處死,取脾臟、胸腺,用濾紙吸去各臟器表面血污,分別稱量濕重并記錄,按照如下公式計(jì)算臟器指數(shù):

臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/小鼠體重(g)

表2 小鼠一般狀況觀察Table 2 General condition of mice

1.2.5 ELISA試劑盒測(cè)定血清細(xì)胞因子 參考郭偉[8]方法取眼球血于潔凈無(wú)菌的離心管中,室溫靜置1 h后3000 r/min離心10 min,取上清即為血清。按照試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及白細(xì)胞介素-12(IL-12)的含量。

1.2.6 單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定 參考何釗[9]采用碳粒廓清試驗(yàn)測(cè)定6組小鼠單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能,方法稍作改動(dòng)。

末次給藥2 h后,于小鼠尾靜脈注入用0.9% NaCl稀釋了5倍的印度墨汁(0.1 mL/10 g bw),在注入墨汁后的2 min和10 min,分別從小鼠眼眶取血20 μL,并立刻加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,充分混勻后,取200 μL待測(cè)樣,加入到96孔板中,以0.1% Na2CO3溶液作空白,測(cè)定其A630。

取血后,頸椎脫臼處死小鼠,取脾臟和肝臟,濾紙吸去表面血污后稱重,按下列公式計(jì)算吞噬指數(shù):

K=(lg OD1-lg OD2)/(t2-t1)

吞噬指數(shù)α=體重/(肝重+脾重)×K1/3

其中,K為廓清指數(shù),t1為第一次采血時(shí)間(2 min),t2為第二次采血時(shí)間(10 min),OD1為t1時(shí)的樣品吸光度值,OD2為t2時(shí)的樣品吸光度值,α為校正廓清指數(shù)。

1.2.7 外周白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù) 參考瞿珍[10]使用經(jīng)過(guò)滅菌處理的眼科鑷子摘除小鼠眼球,用抗凝管收集全血,以防血液凝固,并于12 h內(nèi)用全血細(xì)胞分析儀完成白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)和血小板(PLT)計(jì)數(shù)。

1.2.8 脾臟和胸腺石蠟切片的制作及觀察 參考陸文娟[11]小鼠解剖后迅速摘取肝組織切塊為1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的小薄片,放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定24 h,經(jīng)75%、85%、90%、95%、100%、100%梯度酒精分別脫水6、6、2、2、1、0.5、0.5 h。然后經(jīng)二甲苯透明處理、包埋、切片、攤片、撈片、烘片、脫蠟、HE染色、再脫水、再透明、沖洗、封膠,利用光學(xué)顯微鏡觀察脾臟和胸腺的組織結(jié)構(gòu),并采集相關(guān)圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS 13.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異的顯著性,數(shù)據(jù)用X±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般狀況的觀察

5組小鼠第1次注射結(jié)束前后均表現(xiàn)出暴躁生氣等狀態(tài),約5 min后重新穩(wěn)定下來(lái)。第2、3次注射5組小鼠均表現(xiàn)十分抗拒但注射結(jié)束后隨即恢復(fù)穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)3次注射造模完畢后,明顯發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組和RPHM低劑量組小鼠精神較萎靡,活動(dòng)量減少,體重下降且毛色黯淡無(wú)光澤;RPHM中劑量組、RPHM高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組情況好很多,沒(méi)有明顯的萎靡不振,活動(dòng)量正常、體重稍有變化且毛色和順滑度變化不大;而空白對(duì)照組小鼠食欲無(wú)變化,飲水正常,體重增長(zhǎng)明顯,毛色光亮且順滑,行動(dòng)活潑。

RPHM灌胃數(shù)日后,中、高劑量和陽(yáng)性對(duì)照組的3組小鼠不論在精神狀態(tài)、食欲、行動(dòng)靈敏度還是毛色光澤度方面雖不及空白對(duì)照組小鼠,但差距不大,與RPHM低劑量組和模型對(duì)照組相比均有很大改善。這些現(xiàn)象初步表明RPHM對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制型小鼠有一定的免疫增強(qiáng)作用。

2.2 RPHM對(duì)小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

小鼠的體重和臟器指數(shù)也是一種能夠反映動(dòng)物的整體健康狀況的指標(biāo),臟器的萎縮和退行性變化會(huì)導(dǎo)致臟器指數(shù)降低進(jìn)而間接表明臟器功能的衰退。對(duì)6組小鼠的體重和臟器指數(shù)進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果如表3所示。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組免疫抑制型小鼠的體重、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均可見(jiàn)顯著降低,表明環(huán)磷酰胺會(huì)明顯損傷小鼠器官,使其明顯萎縮,免疫抑制型小鼠模型建立成功。與模型對(duì)照組相比,RPHM低、中、高劑量組免疫抑制型小鼠的體重、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均有不同程度的提高,且多大數(shù)指標(biāo)間顯示出了顯著性的差異(P<0.01)。說(shuō)明RPHM對(duì)環(huán)磷酰胺損傷的小鼠免疫器官(即脾臟、胸腺)具有一定的保護(hù)作用,其中RPHM中劑量組較模型對(duì)照組僅表現(xiàn)出體重的顯著性差異(P<0.01),而在免疫器官指數(shù)只有略微提高,并沒(méi)有展示出顯著性差異,但隨著劑量的增加,表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系;而與模型對(duì)照組相比,陽(yáng)性對(duì)照組的免疫抑制型小鼠在體重、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)均顯著提高(P<0.01)。通過(guò)對(duì)比RPHM各劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組可以發(fā)現(xiàn),在體重方面,RPHM低劑量組低于陽(yáng)性對(duì)照組,中、高劑量組則比陽(yáng)性對(duì)照組高;在脾臟指數(shù)方面,RPHM各劑量組均低于陽(yáng)性對(duì)照組;在胸腺指數(shù)方面,RPHM各劑量組均低于陽(yáng)性對(duì)照組,但高劑量組的數(shù)值已十分接近陽(yáng)性對(duì)照組的數(shù)值

表3 RPHM對(duì)小鼠體重及臟器指數(shù)的影響(n=7)Table 3 Effect of RPHM on body weight and organ index in mice(n=7)

2.3 RPHM對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子的影響

細(xì)胞因子(cytokine,CK)是具有調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長(zhǎng)以及損傷組織修復(fù)等多種功能的由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B細(xì)胞增殖,分泌抗體;刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化;刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白,參與炎癥反應(yīng);促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)育[12-13]。對(duì)6組小鼠血清中5種細(xì)胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α及IL-6)的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表4所示。相比于空白對(duì)照組,模型對(duì)照組的免疫低下型小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-12、TNF-α水平均有明顯的降低,且TNF-α差異極顯著(P<0.01);細(xì)胞因子IL-6則可見(jiàn)明顯的上升,差異同樣顯著(P<0.05),說(shuō)明環(huán)磷酰胺可以抑制細(xì)胞因子IL-2、IL-12、TNF-α的正常分泌,同時(shí)也會(huì)促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6的異常分泌。與模型對(duì)照組相比,RPHM低、中、高劑量組在各個(gè)細(xì)胞因子數(shù)值上均有明顯恢復(fù),其中高劑量組在細(xì)胞因子IL-6、IL-12、IFN-γ上達(dá)到空白對(duì)照組水平,在細(xì)胞因子TNF-α達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組水平;中劑量組在細(xì)胞因子IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ上達(dá)到空白對(duì)照組水平(P>0.01),在細(xì)胞因子TNF-α達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組水平(P>0.01)。RPHM可以明顯促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α的分泌,表現(xiàn)為中、高劑量組免疫抑制型小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α含量均高于陽(yáng)性對(duì)照組。同時(shí)隨著RPHM劑量的增加,5種細(xì)胞因子分泌量均表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明RPHM可以明顯改善細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α的分泌障礙同時(shí)也可以改善細(xì)胞因子IL-6的異常分泌。

表4 RPHM對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響(n=7)Table 4 Effect of RPHM on the concentration of IL-2,IL-12,IFN-γ,TNF-α and IL-6 in serum of mice(n=7)

2.4 RPHM對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

通過(guò)碳粒廓清試驗(yàn)測(cè)定小鼠單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能,可反映RPHM對(duì)小鼠非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用。6組小鼠的吞噬指數(shù)α如表5所示。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組小鼠的吞噬指數(shù)極顯著降低(P<0.01),說(shuō)明環(huán)磷酰胺抑制了小鼠的免疫功能,小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力下降,造模成功。與模型對(duì)照組相比,RPHM低劑量組的吞噬指數(shù)只有小幅提升,而高劑量組的吞噬指數(shù)則大幅提升,且差異極顯著(P<0.01)。RPHM高劑量組的吞噬指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組相比已幾乎沒(méi)有差別,與空白對(duì)照組相比差別很小。表5還顯示隨著RPHM濃度的不斷提高,免疫抑制型小鼠的吞噬指數(shù)也不斷提升,表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。由此可以證明RPHM可一定程度內(nèi)恢復(fù)免疫抑制型小鼠的單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

表5 RPHM對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(n=5)Table 5 Effect of RPHM on phagocytosis of monocyte-macrophage in mice(n=5)

2.5 RPHM對(duì)小鼠造血能力的影響

對(duì)6組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量進(jìn)行分析,結(jié)果如表6所示。與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組免疫抑制型小鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板3個(gè)指標(biāo)均有明顯下降,其中紅細(xì)胞和血小板兩個(gè)指標(biāo)差異顯著(P<0.01),說(shuō)明造模成功。與模型對(duì)照組相比,RPHM各劑量組的3個(gè)指標(biāo)均有明顯上升,且隨著劑量的增大而增加,表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系,其中RPHM高劑量組的3個(gè)指標(biāo)均高于空白對(duì)照組。在3個(gè)指標(biāo)方面,陽(yáng)性對(duì)照組相比模型對(duì)照組也有明顯的上升。結(jié)果表明,RPHM可有效減輕環(huán)磷酰胺對(duì)骨髓的抑制作用,利于骨髓造血功能的恢復(fù)和進(jìn)行,同時(shí)隨著劑量增加會(huì)促進(jìn)骨髓造血功能的增強(qiáng)。

表6 白玉菇多糖對(duì)小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量的影響(n=7)Table 6 Effect of RPHM on the number of peripheral white blood cell(WBC),red blood cell(RBC)and blood platelet(PLT)in mice(n=7)

2.6 RPHM對(duì)小鼠脾臟和胸腺組織形態(tài)的影響

2.6.1 RPHM對(duì)小鼠脾臟組織形態(tài)的影響 空白對(duì)照組(圖1A):小鼠脾臟可見(jiàn)分界清晰的白髓與紅髓,白髓染色顏色深,說(shuō)明淋巴細(xì)胞數(shù)量多,脾中央動(dòng)脈清晰可見(jiàn)。脾小梁不規(guī)則分布于脾臟中,未見(jiàn)組織壞死。

模型對(duì)照組(圖1B):小鼠脾臟組織發(fā)生嚴(yán)重病變,白髓與紅髓結(jié)構(gòu)紊亂,變形嚴(yán)重,二者之間分界極難分辨,白髓內(nèi)球狀的脾中央動(dòng)脈消失,且染色顏色較淺,說(shuō)明淋巴細(xì)胞數(shù)量較少,且未見(jiàn)完整的脾小梁,整體組織出現(xiàn)較高程度的壞死。

陽(yáng)性對(duì)照組(圖1C):小鼠脾臟組織損傷得到顯著改善。脾臟白髓與紅髓界線較為清晰,白髓染色顏色較深,說(shuō)明淋巴細(xì)胞數(shù)量較多,且可見(jiàn)清晰的脾中央動(dòng)脈。脾小梁結(jié)構(gòu)較為完整。但整體組織結(jié)構(gòu)不如空白對(duì)照組完整和清晰,說(shuō)明RPHM可一定程度內(nèi)減輕環(huán)磷酰胺對(duì)脾臟的損傷,但實(shí)驗(yàn)期內(nèi)無(wú)法使其恢復(fù)至正常水平。

RPHM低劑量組(圖1D):小鼠脾臟組織發(fā)生明顯病變,可見(jiàn)模糊的白髓與紅髓分界線,但白髓結(jié)構(gòu)不完整。白髓面積較小且染色較淺,說(shuō)明淋巴細(xì)胞數(shù)量較少。脾中央動(dòng)脈消失,脾小梁結(jié)構(gòu)不完整。但與模型組相比,小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)有所改善,說(shuō)明RPHM對(duì)于環(huán)磷酰胺損傷小鼠脾臟有一定改善作用。

RPHM中劑量組(圖1E):與低劑量組相比,RPHM中劑量組小鼠的脾臟損傷情況得到一定改善。小鼠脾臟白髓與紅髓界線較清晰,白髓面積增大、染色變深且結(jié)構(gòu)較完整,說(shuō)明其中的淋巴細(xì)胞明顯增多,脾中央動(dòng)脈清晰可見(jiàn),可見(jiàn)結(jié)構(gòu)較為完整的脾小梁。隨著RPHM劑量的增加,其對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠脾臟的改善作用也在增加,呈現(xiàn)了一定的正向劑量-效應(yīng)關(guān)系。

RPHM高劑量組(圖1F):小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)損傷較輕,其白髓與紅髓分界較清晰,白髓結(jié)構(gòu)完整,面積大于RPHM中劑量組小鼠脾臟的白髓,脾中央動(dòng)脈清晰可見(jiàn),且存在較為明顯的脾小梁組織結(jié)構(gòu)。但其白髓、紅髓面積明顯低于空白對(duì)照組。說(shuō)明高劑量的RPHM可有效改善環(huán)磷酰胺對(duì)脾臟的損傷,且呈現(xiàn)了一定的正向劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖1 RPHM對(duì)小鼠脾臟組織病理變化的影響(HE染色,100×)Fig.1 Effects of RPHM on pathological changes of spleen in mice(HE staining,100×)注:WP:white pulp,白髓;RP:red pulp,紅髓;CA:central arteriole,中央動(dòng)脈;T:trabeculae,脾小梁。

與模型組相比RPHM中、高劑量組可明顯改善免疫抑制型小鼠脾臟的病變,改善結(jié)構(gòu)完整度,但在實(shí)驗(yàn)期內(nèi),無(wú)法恢復(fù)脾臟的組織結(jié)構(gòu)至正常水平。

2.6.2 RPHM對(duì)小鼠胸腺組織形態(tài)的影響 空白對(duì)照組(圖2A):小鼠胸腺組織可見(jiàn)分界清晰的皮質(zhì)與髓質(zhì),皮質(zhì)中細(xì)胞密集,染色較深,髓質(zhì)中細(xì)胞相對(duì)稀疏,染色較淺,且可見(jiàn)胸腺小體散在分布于髓質(zhì)中,未見(jiàn)組織變性壞死現(xiàn)象。

模型對(duì)照組(圖2B):小鼠胸腺組織出現(xiàn)嚴(yán)重病變,結(jié)構(gòu)混亂,皮質(zhì)與髓質(zhì)無(wú)清晰分界,皮質(zhì)區(qū)變薄變小,髓質(zhì)區(qū)明顯增大,且皮髓質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯降低,排列疏松,染色較淺,無(wú)法見(jiàn)到胸腺小體,說(shuō)明環(huán)磷酰胺會(huì)破壞小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu),破壞其中的免疫細(xì)胞,造成小鼠免疫力的下降。

圖2 RPHM對(duì)小鼠胸腺組織病理變化的影響(HE染色,100×)Fig.2 Effects of RPHM on pathological changes of thymus in mice(HE staining,100×)注:Co:cortex,皮質(zhì);M:medulla,髓質(zhì);TC:thymic corpuscles,胸腺小體。

陽(yáng)性對(duì)照組(圖2C):與模型組相比,小鼠胸腺組織損傷得到顯著改善。皮質(zhì)與髓質(zhì)分界比較清晰,皮質(zhì)中細(xì)胞密度較高,染色較深,髓質(zhì)區(qū)可見(jiàn)少量胸腺小體。可以說(shuō)明,RPHM對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠胸腺具有較好的修復(fù)作用。

RPHM低劑量組(圖2D):小鼠胸腺組織出現(xiàn)較明顯的病變,皮質(zhì)區(qū)變薄變小,髓質(zhì)區(qū)明顯增大,且皮質(zhì)區(qū)由于細(xì)胞減少造成染色顏色較淺,無(wú)法見(jiàn)到胸腺小體。但相比于模型對(duì)照組,RPHM低劑量組小鼠胸腺組織可見(jiàn)分界比較清晰的皮質(zhì)與髓質(zhì)?？梢哉f(shuō)明RPHM對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠胸腺具有一定程度的修復(fù)作用。

RPHM中劑量組(圖2E):與低劑量組相比,RPHM中劑量組小鼠胸腺組織的病變情況得到了比較大的改善,可見(jiàn)分界清晰的皮質(zhì)與髓質(zhì),且皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞密度增大,染色較深,已比較接近陽(yáng)性對(duì)照組水平,髓質(zhì)區(qū)可見(jiàn)少量胸腺小體。隨著RPHM劑量的增加,其對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠脾臟的改善作用也在增加,呈現(xiàn)了一定的正向劑量-效應(yīng)關(guān)系,可以說(shuō)明RPHM中劑量對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠胸腺具有較強(qiáng)的修復(fù)作用。

RPHM高劑量組(圖2F):與中劑量組相比,RPHM高劑量組小鼠胸腺組織看不出任何病變情況,皮質(zhì)與髓質(zhì)分界清晰,皮質(zhì)細(xì)胞密度高,染色深,髓質(zhì)內(nèi)的胸腺小體清晰可見(jiàn),整體組織狀態(tài)甚至超過(guò)空白對(duì)照組小鼠。呈現(xiàn)了一定的正向劑量-效應(yīng)關(guān)系,可以說(shuō)明RPHM高劑量對(duì)環(huán)磷酰胺損傷小鼠胸腺具有很強(qiáng)的修復(fù)作用。

與模型組相比RPHM中、高劑量組可明顯改善免疫抑制型小鼠胸腺的病變,改善結(jié)構(gòu)完整度,RPHM高劑量組整體組織狀態(tài)甚至超過(guò)空白對(duì)照組小鼠。

3 討論與結(jié)論

環(huán)磷酰胺為臨床常用廣譜抗腫瘤藥物,可干擾DNA及RNA功能。在干擾腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)影響到正常細(xì)胞,常用于復(fù)制WBC減少癥[14-15]、免疫抑制[16-17]、血虛證[18-19]等實(shí)驗(yàn)。因此,本研究利用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制型小鼠模型。

小鼠體內(nèi)試驗(yàn)表明,連續(xù)14 d灌胃后,RPHM中、高劑量組(60、120 mg/kg bw/d)可明顯提升免疫抑制型小鼠的免疫功能,而RPHM低劑量組(30 mg/kg bw/d)對(duì)免疫抑制型小鼠的免疫功能提升不明顯。RPHM中、高劑量組可明顯提升免疫抑制型小鼠的毛色、活動(dòng)情況、身體狀況、食欲等指標(biāo);RPHM中、高劑量組可明顯提升免疫抑制型小鼠的體重、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù);RPHM中、高劑量組可在一定程度上提高免疫抑制型小鼠IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-α的水平,并改善IL-6的分泌異常情況,使5種細(xì)胞因子指標(biāo)趨于正常。RPHM中、高劑量組可明顯提升免疫抑制型小鼠對(duì)血液中碳粒的清除速率,提升單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能;RPHM中、高劑量組可明顯提升免疫抑制型小鼠血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量,提升骨髓造血功能;RPHM中、高劑量組可明顯改善免疫抑制型小鼠脾臟、胸腺的病變,改善結(jié)構(gòu)完整度。

綜上所述,免疫低下引發(fā)的一系列健康問(wèn)題不容忽視。相關(guān)文獻(xiàn)[20]表明,針對(duì)免疫低下帶來(lái)的問(wèn)題,越來(lái)越多的科研工作者正致力于從微生物和動(dòng)植物中尋找良好的天然免疫增強(qiáng)劑。本研究結(jié)果表明RPHM在一定程度上RPHM可在免疫器官、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子水平上提升環(huán)磷酰胺免疫抑制型小鼠的免疫功能,對(duì)小鼠的特異性及非特異性免疫均具有較好的改善作用。綜上,白玉菇多糖具有廣闊的開發(fā)前景,其保健功能值得進(jìn)一步探索。