姚志仁,李 豫,朱開梅,唐 輝,顧生玖,*

(1.桂林醫(yī)學院藥學院,廣西桂林 541100;2.廣西壯族自治區(qū)中國科學院廣西植物研究所,廣西桂林 541100)

黃花倒水蓮(PolygalafallaxHemsl.)為遠志科遠志屬灌木或小喬木,又名假黃花遠志、黃花參、倒吊黃、吊吊黃、念健、一身保暖、鴨仔兜等,其生長于山谷林下水旁蔭濕處,主要分布于江西,福建、湖南、廣西和云南等地區(qū)[1]。黃花倒水蓮根入藥,性平,味甘、微苦有補氣血、利水滲濕、補脾補肝、活血調(diào)經(jīng)的功效,一般用于治療病后體虛、腰膝酸痛、跌打損傷、急慢性肝炎及抗衰老等[2]。其是壯族、瑤族、苗族等少數(shù)名族的常用藥[3],同時黃花倒水蓮也作為少數(shù)民族藥食兩用藥材[4]。近年來黃花倒水蓮的藥用價值被逐漸重視。

糖尿病是嚴重影響人體健康的疾病。糖尿病的發(fā)生與氧化有密切關(guān)系[5-6],抗氧化劑可減少自由基的產(chǎn)生或直接淬滅體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,并增強機體的抗氧化能力,是預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的有效手段[7],淀粉中的葡萄糖以α-1,4糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵的形式連接。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的參與是人體對食物中淀粉的消化吸收所必須的過程。唾液、腸道內(nèi)淀粉酶的活性可以通過α-淀粉酶抑制劑來抑制,從而阻礙食物中淀粉的消化吸收,來起到降血糖的作用[8]。目前常用的抗氧化劑及α-葡萄糖苷酶抑制劑多為西藥,存在較多毒副作用,也不能有效地控制并發(fā)癥,植物天然產(chǎn)物降糖作用具有多途徑、多靶點、多向性的藥理特點,不僅可降低血糖,還具有抗氧化及降血脂作用[9-11]。α-葡萄糖苷酶抑制劑一般具有單糖或者寡糖結(jié)構(gòu),可有效地抑制糖水解酶的活性,起到有效控制糖尿病患者餐后血糖水平作用[12]。除此之外,α-葡萄糖苷酶抑制劑還具有抗癌、抗艾滋病病毒、抗動脈粥樣硬化等作用[13]。本文采用不同極性的溶劑對黃花倒水蓮乙醇提取物進行萃取,并測定其各部位多酚,黃酮含量。同時對各部位進行了抗氧化以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的測定,為進一步研究和開發(fā)利用該植物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花倒水蓮藥材 中國科學院廣西植物研究所提供,由中國科學院廣西植物研究所唐輝研究員鑒定為遠志科植物黃花倒水蓮(PolygalafallaxHemsl)的干燥根莖;ABTS試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 梯希愛(上海)有限公司;抗壞血酸(VC) 天津福晨化工試劑公司;α-葡萄糖苷酶(5×106U/mL)、4-硝基苯-α-D-葡萄糖苷(pNPG) Sigma公司;阿卡波糖 百靈威科技有限公司;福林一酚(Folin-Ciocalteu)試劑 生工生物工程股份有限公司;沒食子酸 成都市科龍化工試劑廠;槲皮素 天津一方科技有限公司;所有分離用有機溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

HC-350型四兩裝高速中藥粉碎機 武義海納電器有限公司;LQ-C30002型樂祺電子天平 上?，幮码娮涌萍加邢薰?ReadMax 1900型全波長Epoch酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司;N-1210BV-W型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海巴玖實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃花倒水蓮提取物及萃取物制備 取自然風干的黃花倒水蓮干燥品,粉碎,過40目篩,稱取粗粉800 g按料液比1∶10加入95%乙醇,室溫浸泡一周,抽濾并收集濾液,60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃花倒水蓮乙醇提取物,按照同樣方法提取三次。

采用有機溶劑萃取法[14-15]對黃花倒水蓮乙醇提取物進行純化,稱取適量乙醇提取物用純凈水稀釋,采用等體積石油醚反復萃取樣品至石油醚層無色,采用同樣方法分別用乙酸乙酯、正丁醇、氯仿為萃取劑進行萃取,得各部位萃取物以及萃取完剩下的水相部分。

1.2.2 黃花倒水蓮醇提物各萃取物中多酚含量的測定 參照國標法GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[16]中的多酚測定方法,配制一定濃度的沒食子酸標準溶液和待測液,在760 nm處測定吸光度。

1.2.2.1 標準曲線的繪制 參考文獻方法[17]并做修改稱取適量干燥沒食子酸標準品,純水稀釋,配制成0.02 mg/mL沒食子酸標準溶液。分別取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.25 mL沒食子酸標準溶液參照國標法,于760 nm處分別測定其吸光度。

1.2.2.2 多酚含量測定 按照國標法配制[16]待測樣品溶液,于760 nm處測定其吸光度,以超純水代替待測樣品為空白對照。每組實驗平行測定三次。各待測樣品多酚含量表示為mg(沒食子酸當量)/g(黃花倒水蓮各部位質(zhì)量)計算公式如下:

待測樣品中多酚含量 Z=cvk/m

式中:c為待測樣品稀釋后的多酚濃度(mg/mL)由標準曲線擬合得出;v為黃花倒水蓮各待測樣品提取液總體積(mL);k為待測樣品提取液稀釋倍數(shù);m為黃花倒水蓮各部位粉末重量(g)。

1.2.3 黃花倒水蓮醇提物各萃取物中黃酮含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的制備 參考文獻方法[18]并做修改稱取適量干燥槲皮素標準品,純水稀釋,配制成0.125 mg/mL標準溶液。分別吸取標準液0、2、4、6、8、10 mL于25 mL容量瓶中,加入質(zhì)量分數(shù)為5%的NaNO2溶液0.7 mL,搖勻,溶液顏色無明顯變化,靜置5 min,加入質(zhì)量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液0.7 mL,再搖勻,顏色變淺,放置5 min后,加入5 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的NaOH溶液,顏色變成紅色,再用60%乙醇定容至刻度線,搖勻,靜置15 min,測其在510 nm處吸光度值。

1.2.3.2 黃酮含量測定 按照文獻方法[19]配制待測樣品溶液,于510 nm處測定其吸光度,以超純水代替待測樣品為空白對照。每組實驗平行測定三次。各待測樣品黃酮含量表示為mg(槲皮素當量)/g(黃花倒水蓮各部位質(zhì)量)計算公式如下:

待測樣品中黃酮含量Z=cvk/m

式中:c為待測樣品稀釋后的黃酮濃度(mg/mL)由標準曲線擬合得出;v為黃花倒水蓮各待測樣品提取液總體積(mL);k為待測樣品提取液稀釋倍數(shù);m為黃花倒水蓮各部位粉末重量(g)。

1.2.4 ABTS法測定各極性部位總抗氧能力

1.2.4.1 ABTS工作液的制備 按試劑盒說明取相同體積的ABTS溶液以及氧化劑溶液,室溫避光存放12～16h后,用80%乙醇稀釋至35～55倍。

1.2.4.2 標準曲線的制備 按ABTS試劑盒方法96孔板內(nèi)加入200 μL的ABTS工作液再加入10 μL(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L)的Trolox溶液。輕輕混勻,室溫孵育2～6 min后于405 nm波長處測定吸光度。

1.2.4.3 總抗氧能力測定 96孔板內(nèi)加入200 μL ABTS工作液,空白對照組加入10 μL PBS,樣品組加入10 μL不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL)樣品。輕搖混勻。室溫孵育2～6 min,在405 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算出樣品總抗氧能力。

1.2.5 清除羥自由基活性測定 參考文獻方法[20-21],將黃花倒水蓮各部位分別稀釋為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的溶液,相同濃度的VC溶液做對照。取1 mL樣品,分別加入1.8 mmol/L FeSO4溶液2 mL和1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,再加入0.03% H2O2溶液0.1 mL在37 ℃反應30 min,8000 r/min離心10 min,510 nm測定吸光度。樣品對羥自由基的清除率按公式計算

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:1.0 mL提取液+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇+H2O2溶液;A2:1.0 mL提取液+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇+蒸餾水A0:1.0 mL蒸餾水+2.0 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸-乙醇+H2O2溶液。

1.2.6 清除DPPH自由基活性測定 參考文獻方法[22-23]采用DPPH法。2 mL黃花倒水蓮提取物和萃取物乙醇溶液加入1 mL濃度為500 μmol/LDPPH-乙醇溶液?；旌暇鶆蚝笫覝乇芄夥磻?0 min,然后在517 nm波長處測吸光度。陽性對照為VC,樣品對DPPH自由基的清除率按公式計算。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1:2.0 mL提取液+1.0 mL DPPH工作液;A2:2.0 mL提取液+1.0 mL無水乙醇;A0:2.0 mL純水+1.0 mL DPPH工作液。

1.2.7 不同溶劑黃花倒水蓮提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用 參考文獻方法[24-25]取10 μL不同濃度(0.25、0.5、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)的黃花倒水蓮提取物加入96孔板內(nèi),再分別加入10 μL pH7.4磷酸緩沖鹽溶液,10 μL 0.5 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,充分混勻后放置37 ℃孵育15 min,再加入20 μL 3 mmol/L的PNPG溶液,再孵育10 min,加入150 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應。利用酶標儀在405 nm處測定吸光度,分別設(shè)置空白組、對照組、樣品對照組。并計算其IC50大小。按照表1加樣進行實驗,同時以阿卡波糖為陽性對照。

表1 α-葡萄糖苷酶的抑制作用加樣表Table 1 Inhibitory sampling table of alpha-glucosidase

提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用按公式計算:

抑制率(%)=(1-(A1-A2)/A3)×100

式中:A1為樣品組吸光;A2為空白組吸光值;A3為對照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,進行檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花倒水蓮乙醇提取物及各萃取物多酚的含量

2.1.1 標準曲線的繪制 經(jīng)線性擬合得回歸方程Y=19.04X+0.028,決定系數(shù)R2=0.9924,實驗表明沒食子酸在0.01～0.05 mg/g濃度范圍內(nèi)沒食子酸濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(Y為吸光度,X為沒食子酸濃度)。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.1.2 黃花倒水蓮醇提物各萃取物多酚含量 黃花倒水蓮各部位多酚含量見表2。

表2 黃花倒水蓮醇提物各部位的多酚含量Table 2 Polyphenol content in different parts of alcohol extract of P. fallax.

實驗測得乙酸乙酯部位多酚含量高達(483.9±0.8) mg/g,遠高于其他部位多酚含量。黃花倒水蓮各萃取物中多酚含量依次為乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>石油醚部位>水層部位。該結(jié)果表明黃花倒水蓮的多酚集中分布于乙酸乙酯部位,小極性的多酚所占比例較少。采用系統(tǒng)溶劑萃取法對黃花倒水蓮進行分段萃取后可達到多酚的初步富集與分離的目的。

2.2 黃花倒水蓮乙醇提取物及各萃取物黃酮的含量

2.2.1 標準曲線的繪制 經(jīng)線性擬合得回歸方程Y=1.365X+0.001,決定系數(shù)R2=0.9931,實驗表明槲皮素在0.00～0.05 mg/mL濃度范圍內(nèi)槲皮素濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(Y為吸光度,X為槲皮素濃度)。

圖2 槲皮素標準曲線Fig.2 Quercetin standard curve

2.2.2 黃花倒水蓮各萃取物黃酮含量 黃花倒水蓮各萃取物黃酮含量測定結(jié)果見表3。

表3 黃花倒水蓮各部位的黃酮含量Table 3 Flavone content in different parts of P.fallax.

實驗測得石油醚部位黃酮含量高達(53.1±0.57) mg/g,遠高于其他部位黃酮含量。黃花倒水蓮各萃取物中黃酮含量依次為石油醚部位>乙酸乙酯部位>氯仿部位>醇提總>正丁醇部位>水層部位。該結(jié)果表明黃花倒水蓮的黃酮集中分布于石油醚部位。且經(jīng)過初步分離后,石油醚部位黃酮含量遠高于醇提物黃酮含量說明采用系統(tǒng)溶劑萃取法對黃花倒水蓮進行分段萃取后可達到黃酮的初步富集與分離的目的。

2.3 ABTS法測定黃花倒水蓮各萃取部位總抗氧能力

采用總抗氧能力檢測試劑盒(ABTS法)對黃花倒水蓮各提取物進行抗氧化活性檢測,結(jié)果顯示各提取物均有一定的抗氧化活性。

2.3.1 Trolox標準曲線 Trolox的標準曲線見圖3。

圖3 Trolox標準曲線Fig.3 Trolox standard curve

2.3.2 各萃取物的總抗氧能力 如圖4所示黃花倒水蓮各極性部位均有一定的抗氧化能力,且在0～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi),各萃取層總抗氧能力隨著濃度的增長而增長,總體呈現(xiàn)線性關(guān)系。且其抗氧化能力順序為乙酸乙酯部位>石油醚部位>氯仿部位>正丁醇部位>醇提部位>水相部位,乙酸乙酯部位總抗氧能力在0.8 mg/mL時高達(1.027±0.031) mmol·L-1,遠高于同濃度下其他各部位。

圖4 黃花倒水蓮各部位總抗氧能力Fig.4 Total antioxidant capacity of various parts of P.fallax

2.4 對羥自由基的清除能力

黃花倒水蓮乙醇提取物及其各萃取物對羥自由基均表現(xiàn)出不同程度的清除作用,實驗結(jié)果如圖5所示。在實驗濃度范圍內(nèi)乙酸乙酯部位清除羥自由基的活性最強,乙酸乙酯部位在濃度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL對羥自由基的清除率分別為57.1%、64.2%、64.9%、79.0%、92.8%,乙酸乙酯部位各濃度對羥自由基的清除率均高于同濃度下其他各部位清除作用與陽性對照品VC相當,而0.8 mg/mL濃度下氯仿部位、正丁醇部位、石油醚部位、醇提部位、水相部位清除率分別為83.2%、72.6%、67.0%、61.2%、50.7%。黃花倒水蓮醇提物及其各萃取物對羥自由基清除率大小依次為:乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>石油醚部位>醇提部位>水相部位。黃花倒水蓮具有抗氧化活性的成分主要集中在乙酸乙酯部位。

圖5 各萃取極分對羥自由基清除率Fig.5 Scavening rate of extraction fraction against ·OH

2.5 對DPPH自由基清除作用

黃花倒水蓮醇提物及其各提取部位清除DPPH自由基活性測定結(jié)果如圖6所示,黃花倒水蓮醇提物及其各提取部位對DPPH自由基顯示出不同程度的清除活性,隨著濃度升高,對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)線性關(guān)系;乙酸乙酯部位在濃度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL時對DPPH自由基清除率分別為62.9%、69.1%、77.7%、87.6%、93.3%;而當濃度為0.8 mg/mL時,正丁醇部位、氯仿部位、石油醚部位、醇提部位、水相部位清除率分別為83.4%、79.3%、70.2%、68.8%、50.2%,乙酸乙酯部位各濃度對DPPH自由基清除率均遠高于同濃度下其他部位。黃花倒水蓮各部位對DPPH自由基的清除率大小順序為乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>石油醚部位>醇提物>水相部位。

圖6 各萃取極分對DPPH自由基清除率Fig.6 Scavenging rate of each extraction fraction against DPPH free radical

2.6 不同溶劑黃花倒水蓮萃取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同溶劑黃花倒水蓮萃取物對α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)和不同溶劑萃取物的抑制作用結(jié)果見圖7。

圖7 不同萃取物對α-葡萄糖苷酶的半抑制率Fig.7 Semi-inhibitory rate of different extracts on α-glucosidase

通過黃花倒水蓮不同濃度(0.25、0.5、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL)抑制率計算其IC50。各有效部位均對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,乙酸乙酯部位抑制效果最為明顯。黃花倒水蓮各部位對α-葡萄糖苷酶的抑制效果:乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>醇提物>石油醚部位>水相部位。而乙酸乙酯部位IC50為(0.064±0.013) mg/mL,正丁醇部位為IC50為(0.559±0.012) mg/mL均要優(yōu)于陽性對照阿卡波糖IC50(0.867±0.032) mg/mL。說明黃花倒水蓮中發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解在乙酸乙酯部位。

3 結(jié)論

本研究表明黃花倒水蓮各極性部位均有一定的抗氧化活性,相同質(zhì)量濃度下乙酸乙酯部位抗氧化活性優(yōu)于其他部位。乙酸乙酯部位多酚含量最高(483.9±0.8) mg/g,而黃酮含量最多的為石油醚部位(53.1±0.57) mg/g,表明在黃花倒水蓮中總多酚有較好的抗氧化活性作用。通過實驗證明其乙酸乙酯部位對α-葡萄糖苷酶抑制效果遠遠高于陽性對照阿卡波糖。阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)為(0.867±0.032) mg/mL,而乙酸乙酯部位對α-葡萄糖苷酶的半抑制率(IC50)為(0.064±0.013) mg/mL。綜上證明乙酸乙酯部位為黃花倒水蓮抗氧化降血糖最有效部位。通過本實驗可以初步確定該活性部位中主要活性物質(zhì)為多酚類化合物,其最優(yōu)的單一活性成分還需做進一步研究。