闞 望，許姍姍，楊太源，劉 悅，王連春，李紅祥，譚元花，吳德喜，孔寶華*，李成云

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201; 2.西雙版納傣族自治州植保植檢站，云南 景洪 666100; 3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 景洪 666201; 4.玉溪師范學(xué)院，云南 玉溪 653100)

【研究意義】微生物是生態(tài)環(huán)境中的重要成員，尤其細(xì)菌，對(duì)生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著十分重要的作用。植物群落的結(jié)構(gòu)、組成和多樣性以及植物與微生物群落間的相互作用是由土壤微生物綜合調(diào)控的，是地球生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和多樣性的主要驅(qū)動(dòng)者。無論是健康植株還是患病植株，其體內(nèi)、體表均存在大量細(xì)菌[1]。幾乎所有植物中都伴隨有內(nèi)生細(xì)菌，其與宿主植物在長期共同進(jìn)化過程中形成密切關(guān)系，是植物微生物生態(tài)系統(tǒng)的主要成員，它們與植物互作共生，它們的代謝活動(dòng)及產(chǎn)物可促進(jìn)宿主植物適應(yīng)外界各種來自生物、非生物的環(huán)境壓力，維持生態(tài)系統(tǒng)平衡[2]。非人工培養(yǎng)的一些細(xì)菌門主要分布在不同植物的葉際環(huán)境中。葉際細(xì)菌群落具有特定的適應(yīng)性，并且表現(xiàn)出與宿主植物和細(xì)菌群落成員之間的多重關(guān)系[3]。因此，研究與合理利用植物的內(nèi)生微生物具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】西雙版納是中國，乃至亞洲生物多樣性最為豐富的地區(qū)之一[6]。由于熱帶雨林起源古老，古生物群一直演變延伸至今，保存了一些有研究價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的第三紀(jì)以前的古生物殘余，形成了中國熱帶生物最密集的地區(qū)，擁有大量最珍貴、稀有的生物物種，素有“植物王國”、“天然花園”、“生物物種基因庫”的美譽(yù)。豐富的植物資源勢必孕育豐富的微生物種群?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于細(xì)菌群落的研究，在水環(huán)境的細(xì)菌群落與土壤細(xì)菌群落方面有相關(guān)研究報(bào)道[7-10]。但葉際細(xì)菌群落研究報(bào)道較少，熱帶雨林葉際細(xì)菌群落的研究更少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】高通量測序研究微生物多樣性，相對(duì)于傳統(tǒng)的生態(tài)學(xué)方法應(yīng)用較多，且能在無寄主信息的前提下，更為靈敏、準(zhǔn)確地反映出樣品中微生物群落的真實(shí)情況[11]。應(yīng)用高通量測序方法研究該區(qū)域葉際細(xì)菌種群與多樣性，對(duì)進(jìn)一步揭示熱帶雨林的微生物資源及其在該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)中的功能，探明潛在植物病原致病菌，開發(fā)該區(qū)域有生物防治前景的有益細(xì)菌資源等都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集

以云南西雙版納熱帶雨林無病害癥狀的健康植物為研究對(duì)象，2017年5月在景洪市的大渡崗鄉(xiāng)、景洪市周邊，勐?？h的勐養(yǎng)鎮(zhèn)、勐宋鄉(xiāng)和保塘村，勐臘縣的勐侖鎮(zhèn)自然保護(hù)區(qū)和曼搞保護(hù)區(qū)等7個(gè)代表性地點(diǎn)隨機(jī)采集植物葉片樣本，每份樣品約200 g，低溫保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室，用錫箔紙包裹，迅速置于液氮中冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃下長期保存。記錄采樣地點(diǎn)的經(jīng)緯度與海拔。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及高通量測序 用CTAB方法提取樣品總DNA，步驟如下：將植物組織洗干凈，用75 %的酒精表面消毒4～5 min，用去離子水沖洗3次；將樣品放在研缽中加入液氮搗碎，迅速轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，應(yīng)用CTAB方法提取DNA。目前，微生物多樣性研究主要是在編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行的。細(xì)菌主要是基于16S區(qū)，16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的DNA序列。提取樣品總DNA后，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，在引物末端加上測序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格的文庫用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測序。高通量測序(如Illumina HiSeq等測序平臺(tái))得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Sequenced Reads)，結(jié)果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式存儲(chǔ)，其中包含測序(Reads)的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 對(duì)原始測序序列進(jìn)行過濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列(Tags)，將優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，劃分OTUs，并根據(jù)OTUs的序列組成得到其物種分類?；贠TUs分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得各樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上的群落結(jié)構(gòu)圖、物種聚類熱圖、屬分類學(xué)水平系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹及分類學(xué)樹狀圖。通過Alpha多樣性分析研究單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計(jì)各樣品在97 %相似度水平下的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，繪制樣品稀釋曲線及等級(jí)豐度曲線。通過 Beta多樣性分析比較不同樣品在物種多樣性方面(群落組成及結(jié)構(gòu))存在的差異。根據(jù)距離矩陣獲得相應(yīng)距離下的樣品層次聚類(UPGMA)樹、NMDS分析、樣品聚類熱圖及樣品PCA、PCoA圖(有分組信息)、基于多種距離的箱線圖等。通過組間差異顯著性分析在不同組間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本OTUs

對(duì)西雙版納熱帶雨林7個(gè)采樣點(diǎn)的39個(gè)植物樣品測序，共獲得 2 720 883對(duì) Reads，雙端 Reads 拼接、過濾后共產(chǎn)生2 368 669條Clean tags，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生60 735條 Clean tags，測定的細(xì)菌序列分析97 %以上同源的為一個(gè)OTU，分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌OTUs數(shù)量在31～818，樣本間存在差別(表1)。ACE指數(shù)在99.3484～904.9273，Shannon指數(shù)在0.120～5.3132，文庫覆蓋率都在0.99以上。說明測得的OTU能基本反映所研究的樣品細(xì)菌的群落組成。選擇分析曼搞保護(hù)區(qū)與景洪市大渡崗鄉(xiāng)兩個(gè)代表性地點(diǎn)的木本與草本OTU。從圖1A可知，曼搞保護(hù)區(qū)A01、A03、A06木本植物樣本細(xì)菌OTUs分別是48、135、794，各個(gè)樣本OTUs不同，多樣性存在較大差別。檢測到共有OTUs 8種。從圖1B可知景洪市大渡崗鄉(xiāng)木本植物A33、A38、A39分別檢測到細(xì)菌OTUs 165、199、778，樣本之間OTUs差別較大，多樣性存在明顯差別。重疊檢測到共有OTUs為19。從圖1C可知曼搞保護(hù)區(qū)草本植物從A04、A08、A10，樣本分別檢測到細(xì)菌OTUs分別為112、52、63，不同樣本OTUs明顯不同，顯示細(xì)菌多樣性不同。這些樣本的細(xì)菌OTUs具有相互重疊，共有細(xì)菌OTUs有8種。從圖1D可知，從景洪市大渡崗鄉(xiāng)草本植物A32、A36、A37分別檢測到細(xì)菌OTUs為102、144、308。樣本之間細(xì)菌OTUs差別極大，多樣性存在明顯差別。重疊檢測到共有OTUs數(shù)量為37。

A：曼搞保護(hù)區(qū)木本植物檢測到細(xì)菌OTUs；B：景洪市大渡崗鄉(xiāng)木本植物檢測到細(xì)菌OTUs；C：曼搞保護(hù)區(qū)草本植物檢測到細(xì)菌OTUs；D：景洪市大渡崗鄉(xiāng)草本植物檢測到細(xì)菌OTUsA: The OTUs of bacteria were detected in woody plants in mangao nature reserve. B: The OTUs of bacteria were detected in woody plants in dadugang Township, Jinghong City. C: The OTUs of bacteria were detected in herbaceous plants in mangao nature reserve. D: The OTUs of bacteria were detected in herbaceous plants in dadugang Township, Jinghong City圖1 西雙版納熱帶雨林2個(gè)地點(diǎn)草本、木本植物細(xì)菌OTUs韋恩圖Fig.1 The Venn diagram of the OTUs ofbacterium from herbaceous and woody plants in two sites of Xishuangbanna tropical rainforest

對(duì)西雙版納熱帶雨林7個(gè)地點(diǎn)的木本、草本植物檢測到的細(xì)菌OTUs進(jìn)行分析(圖2)，圖2A木本植物所測得的細(xì)菌OTUs，A04、A08、A10等23個(gè)樣品共同OTUs為4種。圖2B草本植物所測得的細(xì)菌OUTs，A01、A03、A06等16個(gè)樣品共同OTUs為5種。草本樣本細(xì)菌共有的OTUs較木本植物細(xì)菌共有的OTUs相差不大。木本植物細(xì)菌樣本之間的OTUs差別相對(duì)較草本植物小。

2.2 西雙版納熱帶雨林植物葉部檢測到的細(xì)菌門、綱、目與屬

在西雙版納熱帶雨林，在門(phylum)水平上主要檢測到Cyanobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes，此外，還有未歸類細(xì)菌門。在綱(class)水平上高頻檢測到Alphaproteobacteria(相對(duì)豐富度43 %)、Bacteroidia(相對(duì)豐富度34 %)、Bacilli(相對(duì)豐富度13 %)、Clostridia(相對(duì)豐富度15 %)及未歸類細(xì)菌綱。在目(order)水平上主要檢測到Bacteroidales、Clostridiales、Lactobacillales、Rhizobiales、Sphingomonadales及未歸類細(xì)菌目。在屬種水平上主要檢測到Lactobacillus(相對(duì)豐富度12 %)、Sphingomonas(相對(duì)豐富度3 %)、Methylobacterium(相對(duì)豐富度5 %)。其他細(xì)菌屬檢出相對(duì)豐富度較低。此外，還檢測到未歸類真菌及其他。

A：西雙版納熱帶雨林7個(gè)采樣地點(diǎn)所有木本植物所測得的細(xì)菌OTUs;B：西雙版納熱帶雨林7個(gè)采樣地點(diǎn)所有草本植物所測得的細(xì)菌OTUsA: the bacterial OTUs of all woody plants in seven sampling sites of Xishuangbanna tropical rainforest. B: the bacterial OTUs of all herbaceous plants in seven sampling sites of Xishuangbanna tropical rainforest圖2 西雙版納熱帶雨林草本、木本植物細(xì)菌的OTUs韋恩圖Fig.2 The venn diagram of the OTUs of bacterium from the herbaceous and woody plants in Xishuangbanna tropical rainforest

圖3 綱(class)水平上檢出細(xì)菌物種Fig.3 The bacterium classes distribution at class level

2.3 主要葉際細(xì)菌屬群地理與植物分布

分析7個(gè)自然保護(hù)區(qū)葉部細(xì)菌檢測出的屬種，發(fā)現(xiàn)7個(gè)調(diào)查點(diǎn)高頻檢出的細(xì)菌屬種存在差別。 列出2個(gè)地點(diǎn)的代表性細(xì)菌(表1)，其中Methylobacterium、Acinetobacte、Pseudomonas、Sphingomonas分布最為普遍，Pantoea、Aureimonas，Lactobacillus分布普遍，其他細(xì)菌屬Geobacter、Exiguobacterium、Nocardioides、Hymenobacter、Escherichia-Shigella、Pseudarthrobacter、Comamonas、Vogesella、Massilia與Aeromonas有局部分布。此外，在7個(gè)調(diào)查點(diǎn)均檢測到其他細(xì)菌。

分析檢測到的細(xì)菌屬的分布(表1)，在木本植物上，檢測出Escherichia-Shigella、Sphingomonas、Pantoea等植物致病菌；同時(shí)檢測到有益菌Lactobacillus、Acinetobacter、Methylobacterium、Pseudonocardia、Alloprevotella、Bacillus、Microbacterium、Aureimonas等；還檢測到已經(jīng)報(bào)道的其他細(xì)菌：Chroococcidiopsis、Nocardioides、Massilia、Hymenobacter等。在草本植物上檢測到植物致病菌有Sphingomonas、Haemophilus、Pantoea等；有益菌有Methylobacterium、Streptococcus、Pseudomonas、Lactobacillus、Acinetobacter、Microbacterium、Aureimonas、Desulfovibrio等；已報(bào)道的細(xì)菌有Amnibacterium、Geobacter、Actinomycetospora、Pseudarthrobacter、Psychromona、Quadrisphaeras、Exiguobacterium，以及未鑒定的細(xì)菌Pseudokineococcus。在未鑒定植物上檢測到植物致病細(xì)菌有Sphingomonas、Pantoea；有益菌有Pseudomonas、Lactobacillus、Acinetobacter、Aureimonas、Desulfovibrio；生態(tài)環(huán)境中報(bào)道的細(xì)菌Hymenobacter、Quadrisphaera等，以及未鑒定的細(xì)菌Pseudokineococcus。

分析檢測到的主要細(xì)菌的植物分布，顯示每個(gè)植物具有獨(dú)特的葉部細(xì)菌種類。其中Methylobacterium、Acinetobacte分布最廣，Pseudomonas、Sphingomonas次之，以上種類在大部分木本、草本與未鑒定植物中檢測到；Geobacter、Exiguobacterium、Nocardioides、Hymenobacter、Escherichia-Shigella、Pseudarthrobacter、Comamonas、Vogesella、Massilia與Aeromonas等細(xì)菌，寄主分布較窄，其中有的細(xì)菌種類只在1種植物1個(gè)采樣調(diào)查點(diǎn)檢測到。

表1 西雙版納熱帶雨林2個(gè)地點(diǎn)檢出的主要細(xì)菌的植物分布Table 1 Plant distribution of the main bacteria genera detected at two sites of Xishuangbanna

續(xù)表1 Continued table 1

注：*表示細(xì)菌在環(huán)境中有報(bào)道；●表示致病菌；+表示有益菌；×表示未知細(xì)菌。

Note: * indicates that bacteria have been reported; ● is pathogenic bacteria; + is beneficial bacteria; × is unknown bacteria.

3 討 論

在檢測到的細(xì)菌屬種中，分析其居住范圍和分布關(guān)系，以Methylobacterium、Acinetobacte分布最為廣泛，Pseudomonas、Sphingomonas次之，Pantoea、Aureimonas與Lactobacillus分布普遍。局部分布的細(xì)菌有Geobacter、Exiguobacterium、Nocardioides、Hymenobacter、Escherichia-Shigella、Pseudarthrobacter、Comamonas、Vogesella、Massilia與Aeromonas。此外，在所有地點(diǎn)均檢測到其他細(xì)菌。檢測的細(xì)菌中致病菌有4種，有益菌有9種，其他細(xì)菌5種。據(jù)報(bào)道，Methylobacterium為有益菌[12]，促進(jìn)植物生長。Acinetobacte為內(nèi)生細(xì)菌[13]，Sphingomonas[14]、Pantoea[15]、Escherichia-Shigella[16]等為致病菌，Lactobacillus為益生菌[17]，Pseudonocardia為有益菌[18]。熱帶雨林生態(tài)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，這些潛在植物病原菌與農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的致病細(xì)菌的致病性差別，如何從熱帶雨林演化成農(nóng)田強(qiáng)致病菌值得今后深入研究。研究發(fā)現(xiàn)的有益細(xì)菌，值得深入研究開發(fā)利用。此外，研究發(fā)現(xiàn)大量未歸類與未知細(xì)菌，說明西雙版納熱帶雨林葉際細(xì)菌研究很少，深入研究能夠豐富分類細(xì)菌學(xué)與細(xì)菌功能研究，揭示熱帶雨林生物多樣性的意義。

4 結(jié) 論

選取2個(gè)代表性地點(diǎn)的木本、草本檢測到細(xì)菌的OTUs，發(fā)現(xiàn)草本植物中檢測到的細(xì)菌OTUs普遍比木本植物多，細(xì)菌多樣性更豐富。西雙版納曼搞保護(hù)區(qū)細(xì)菌OTUs變化幅度較大，草本植物檢測的除了共同重疊的OTUs之外木本與草本樣本來源的細(xì)菌具有獨(dú)特的OTUs。草本植物比木本植物更容易成為農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境病原的原始來源地。關(guān)于熱帶雨林細(xì)菌的演化，在熱帶雨林生態(tài)穩(wěn)定性中起著重要作用，值得深入研究。