馮 銳，郭 輝，陳 燦，劉百龍，張曉麗，秦學(xué)毅

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】稻褐飛虱[(NilaparvatalugensSt?l)，簡稱BPH]是我國及亞洲地區(qū)水稻生產(chǎn)中為害最嚴(yán)重的害蟲。褐飛虱具有生長周期短、繁殖力強(qiáng)、易遷飛等生活習(xí)性，主要通過刺吸危害，造成水稻減產(chǎn)或絕收[1]，在我國發(fā)生面積達(dá)2500萬hm2/年，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也成為2003年以來稻米價(jià)格上升的主要原因之一[2]。目前，在我國大面積推廣的主栽水稻品種中對稻飛虱具有抗性的品種不多，稻田生態(tài)系統(tǒng)基本失去了抵御稻飛虱入侵的第一道天然屏障，抗性品種的嚴(yán)重缺乏已成為稻飛虱連續(xù)暴發(fā)的重要原因之一。分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)在水稻育種應(yīng)用中已逐步得到發(fā)展和完善，并成為一種重要的育種技術(shù)[3-4]。通過分子標(biāo)記輔助選擇有利基因?qū)ΜF(xiàn)有的資源或品種進(jìn)行遺傳改良，已成為抗褐飛虱品種選育的重要途徑[5]?？剐杂N以抗性基因的鑒定為前提，但是，抗蟲鑒定受蟲源、環(huán)境等影響較大，且耗時(shí)費(fèi)力。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可在早期世代選擇抗蟲株系，不受蟲源和環(huán)境影響，可提高育種效率[6-10]。因此，通過分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合傳統(tǒng)育種技術(shù)進(jìn)行抗褐飛虱水稻恢復(fù)系選育，對雜交稻抗性育種的種質(zhì)資源選擇具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，培育和種植抗蟲水稻品種已成為安全、有效實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)業(yè)綠色生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展、降低農(nóng)藥使用量的途徑之一[11]，通過分子標(biāo)記輔助選擇，利用有利基因?qū)ΜF(xiàn)有的資源或品種進(jìn)行遺傳改良已經(jīng)成為行之有效的方法[12]。分子標(biāo)記選擇技術(shù)可有效提高目標(biāo)性狀的選擇效率，縮短育種周期[13]。在20世紀(jì)60年代，Pathak等[14]首次鑒定出栽培稻Mudgo為抗褐飛虱品種。李月鯤等[15]從304份水稻品種(組合)中篩選出抗褐飛虱性能穩(wěn)定的R373(組合)作為培育抗褐飛虱水稻品種的基礎(chǔ)材料使用。張建福等[16]將分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)與傳統(tǒng)育種結(jié)合，創(chuàng)制了米質(zhì)優(yōu)、配合力好且抗白背飛虱的新恢復(fù)系材料。閆成業(yè)等[17]利用分子標(biāo)記輔助選擇改良了水稻恢復(fù)系R1005的褐飛虱抗性。羅世友等[18]利用分子標(biāo)記輔助選育得到抗褐飛虱的改良恢復(fù)系。徐鵬等[19]通過分子標(biāo)記輔助選育，使恢復(fù)系R813的稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性明顯提高。降好宇等[20]利用分子標(biāo)記輔助選擇手段檢測攜帶廣譜抗稻瘟病基因Pi9的水稻品系75-1-127，發(fā)現(xiàn)其含有褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15，可作為抗源應(yīng)用于水稻褐飛虱抗性育種。李進(jìn)波等[21]在2006年已利用分子標(biāo)記輔助選擇獲得160份目標(biāo)基因純合且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的株系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，市場上推廣的水稻品種中抗褐飛虱品種為數(shù)不多，而少有的抗褐飛虱品種中對褐飛虱抗性較差，水稻生產(chǎn)中仍然依賴于化學(xué)藥劑來防治褐飛虱，但關(guān)于以分子標(biāo)記輔助選擇含抗褐飛虱基因水稻品種的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以高抗褐飛虱水稻品系HS204為母本、恢復(fù)系明恢63為父本，通過雜交改良、回交和自交選育，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇和抗蟲鑒定，在改良后代中選擇褐飛虱抗性強(qiáng)的恢復(fù)系材料，為抗褐飛虱雜交稻育種提供良好的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以HS204為供體親本(母本)，其高抗褐飛虱的抗性來源于廣西普通野生稻；以水稻恢復(fù)系明恢63為受體親本(父本，輪回親本)；以Ptb33為抗蟲對照(CK-R)；以TN1為感蟲對照(CK-S)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 選育流程 以HS204為母本、恢復(fù)系明恢63為輪回親本進(jìn)行雜交，經(jīng)2次回交后多次自交，從BC1F1世代開始進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選育，在分離群體中篩選含抗褐飛虱基因的植株繼續(xù)與輪回親本回交，后代不斷自交，選育出抗性基因純合、農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)異的株系，最后進(jìn)行苗期褐飛虱抗性鑒定。

1.2.2 分子標(biāo)記 利用所篩選的與抗源HS204抗褐飛虱基因緊密連鎖的多態(tài)性SSR標(biāo)記M4-10(F：5′-GTGTAGCTGCTAGGCCGAAC-3′，R：5′-TTCCTTT CGCTACGTTGGAC-3′)和INDEL標(biāo)記M4-228(F：5′-TGTGCAGCTTTTTCAGGTTG-3′，R：5′-ATGTCGTTCCTTTTGCTGCT-3′)，對分離群體中的抗性基因進(jìn)行跟蹤檢測，選擇攜帶目標(biāo)基因的株系。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 參照CTAB法從水稻幼嫩葉片中提取DNA樣品。PCR反應(yīng)體系10.0 μl：DNA模板1.0 μl，10×PCR Buffer(含Mg2+) 1.0 μl，10 mM dNTP 0.2 μl，5 U/μlTaqDNA Polymerase 0.1 μl，10 μM上、下游引物各0.2 μl，ddH2O補(bǔ)足10.0 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃停止反應(yīng)。參考李進(jìn)波等[10]的方法進(jìn)行電泳和銀染檢測。

1.2.4 褐飛虱苗期抗性鑒定 供試蟲源為廣西南寧田間采集混合生物型，在網(wǎng)室用TN1飼養(yǎng)繁殖備用，以褐飛虱生物型II為主，與部分越南九龍江型、孟加拉型和生物型I構(gòu)成混合生物型。參照苗期集團(tuán)篩選法將試驗(yàn)材料分為若干組，取各組每份適量種子，催芽后條播于52 cm×33.5 cm×7.5 cm的鋁托盤內(nèi)，每行播20～25 粒，當(dāng)苗長至3 葉1心時(shí)去除小苗、弱苗，保留健壯一致的苗并統(tǒng)計(jì)苗數(shù)，按每株5～8頭接入2～3齡若蟲，置于紗網(wǎng)網(wǎng)室中，自然光照，室溫25～30 ℃，保持托盤一直有水。在感蟲對照品種TN1死亡7 d后調(diào)查對照受害癥狀等級表現(xiàn)，按照表1統(tǒng)計(jì)各株系的抗性水平。

1.2.5 改良株系及雜交配組組合主要農(nóng)藝性狀測定 2018年夏季在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗(yàn)田種植改良株系與自育不育系1A、2A和10A進(jìn)行配制的雜交組合，以天優(yōu)華占為改良株系和雜交組合的對照(CK)。每個(gè)組合設(shè)3個(gè)重復(fù)，每小區(qū)種植40苗，每行種8株，單株插，密度為16.7 cm×20.0 cm，常規(guī)田間管理。記錄生育期，在成熟期每小區(qū)選取3株，考察株高、單株有效穗、穗長、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀。

表1 褐飛虱抗性分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grade standard of resistance to brown planthopper in Oryza rufipog

圖1 MAS改良抗性水稻恢復(fù)系的育種路線Fig.1 The technical approach of improving rice resistant restorer line by MAS

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良株系的構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助選擇

從圖1可看出，雜合單株同時(shí)含有母本(供體親本HS204)、父本(受體親本明恢63)雙親的2個(gè)雙條帶，陽性純合單株只有與HS204相同的2個(gè)條帶，隱性純合單株只有與明恢63相同的2個(gè)單條帶。利用分子標(biāo)記對單株進(jìn)行檢測，共檢測到16個(gè)抗性基因純合單株，從中篩選獲得RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH-262共4個(gè)田間選擇農(nóng)藝性狀與受體親本相似的恢復(fù)系單株。

M：200 kb Marker；P1：供體親本HS204；P2：受體親本明恢63；F1：雜交一代；泳道1～30：BC2F2代分離群體單株M：200 kb Marker；P1：Donor parent HS204；P2：Recipient parent Minghui 63；F1：First-filial generation；Lane 1-30：Segregation population of BC2F2圖2 分子標(biāo)記檢測BC2F2代單株的部分檢測結(jié)果Fig.2 Detection of molecular marker in partial individuals of BC2F2 population

表2 育成株系對褐飛虱的抗性鑒定結(jié)果Table 2 Identification of resistance of restorers against BPH

2.2 改良株系對水稻褐飛虱的抗性鑒定

抗性評價(jià)工作在南寧市廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室進(jìn)行，以感蟲品種TN1、抗蟲品種PTB33為對照，對選擇的4個(gè)株系RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH-262進(jìn)行褐飛虱抗性鑒定。從抗性鑒定結(jié)果(表2)可看出，感蟲品種TN1全部枯死(9級)，4個(gè)中選株系RMH-3(3.9級)、RMH-58(1.9級)、RMH-153(3.1級)和RMH-262(1.8級)表現(xiàn)抗和高抗褐飛虱。說明改良株系的抗性較受體親本明恢63明顯提高。

2.3 改良株系及雜交配組的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

將選育的4個(gè)恢復(fù)系改良株系與自育的不育系1A、2A和10A進(jìn)行配組，獲得12個(gè)測交組合，對其8個(gè)主要農(nóng)藝性狀的分析結(jié)果(表3)表明，各測交組合的株高在102.5～120.5 cm，其中1A×RMH-3的株高最矮，明顯矮于父本RMH-3，而2A×RMH-262的株高最高，明顯高于父本RMH-262；改良株系RMH-3與3個(gè)不育系配組的3個(gè)組合的有效穗數(shù)(分別為7.5、8.5和8.0穗/株)均比父本RMH-3有所增加，改良株系RMH-58與不育系1A、2A配組組合的有效穗數(shù)(分別為8.0和7.5穗/株)較父本RMH-58明顯增加，而與不育系10A配組組合的有效穗數(shù)明顯減少；4個(gè)改良株系中，除RMH-58外其余3個(gè)改良株系的穗長(26.5～27.8 cm)均不同程度長于其父本明恢63，而12個(gè)雜交組合中，除2A×RMH-153外其他11個(gè)雜交組合的穗長(27.5～32.0 cm)均長于受體親本明恢63；4個(gè)改良株系的每穗實(shí)粒數(shù)(172.8～233.0粒)均明顯少于其父本明恢63，而12個(gè)雜交組合的每穗實(shí)粒數(shù)或多于或少于受體親本明恢63；4個(gè)改良株系的結(jié)實(shí)率與12個(gè)雜交組合無明顯差異，而4個(gè)改良株系和12個(gè)雜交組合的千粒重和單穗重均明顯高于受體親本明恢63；4個(gè)改良株系谷粒的長寬比除RMH-58稍小于父母本外其余均介于父母本之間，而大部分雜交組合谷粒的長寬比小于供體親本HS204，部分大于受體親本明恢63，部分小于受體親本明恢63。說明改良株系及其配制的多數(shù)雜交組合具有良好的產(chǎn)量表現(xiàn)，部分農(nóng)藝性狀甚至優(yōu)于受體親本明恢63。

表3 改良株系與雜交配組組合的產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)Table 3 The yield and main agronomic traits of the improved lines and their hybrids

表4 改良株系所配組合對褐飛虱的抗性評價(jià)結(jié)果Table 4 Resistance of the improved lines and their combinations against BPH

2.4 改良株系配制雜交組合的抗性評價(jià)

2018年秋季，對改良株系所配制的12個(gè)雜交組合及感蟲品種TN1和抗蟲品種PTB33進(jìn)行抗性評價(jià)，結(jié)果(表4)表明，12個(gè)組合中有4個(gè)組合表現(xiàn)高抗，平均抗級1.8～1.9；有5個(gè)組合表現(xiàn)抗，平均抗級2.7～3.9；有2個(gè)組合表現(xiàn)中抗，平均抗級4.0～4.6，有1個(gè)組合表現(xiàn)感，平均抗級7.0。說明改良株系組配雜交組合的整體抗性表現(xiàn)良好。

3 討 論

目前，分子標(biāo)記輔助選擇在低世代僅對目標(biāo)基因進(jìn)行選擇，無需進(jìn)行抗性鑒定，具有選育效率高、準(zhǔn)確性好、經(jīng)濟(jì)和不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于水稻抗性育種。如夏明元等[22]選育出含Bph14基因的恢復(fù)系R476；李進(jìn)波等[23]通過回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選育，將GD-7的抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)育到受體揚(yáng)稻6號中，獲得了10個(gè)雙基因純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系；蘭艷榮等[24]利用分子標(biāo)記輔助選擇改良水稻光溫敏核不育系華201S的白葉枯病抗性，獲得4個(gè)表現(xiàn)良好的抗性株系；陽海寧等[25]采用回交與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，獲得抗稻白葉枯病基因Xa23和抗稻褐飛虱基因Bph3雙抗性基因聚合系144份；閆成業(yè)等[25]采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)與傳統(tǒng)育種的雜交、回交相結(jié)合，將抗稻瘟病基因Pi9導(dǎo)入R1005中，育成的恢復(fù)系含有抗性基因，抗性較父本明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果與上述研究報(bào)道相似，通過分子標(biāo)記輔助選擇獲得了褐飛虱抗性較父本明恢63明顯增強(qiáng)的恢復(fù)系株系。

野生稻是水稻育種的寶貴種質(zhì)資源。胡杰等[27]研究表明，在水稻中已有30多個(gè)抗褐飛虱主效基因被報(bào)道，其中有20個(gè)基因來源于野生稻，本研究中含有顯性基因抗源的供體親本(母本)HS204也是利用廣西普通野生稻培育獲得的高抗品系。本研究通過分子標(biāo)記輔助選育方法將廣西本土野生稻的優(yōu)良抗性基因與恢復(fù)系明恢63進(jìn)行雜交，結(jié)合苗期鑒定，在后代中選育出對褐飛虱抗性表現(xiàn)較好的4個(gè)改良株系，其農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀表現(xiàn)優(yōu)良，配合力強(qiáng)，可作為配制抗褐飛虱雜交組合的遺傳資源利用。

在實(shí)際生產(chǎn)中，褐飛虱的大暴發(fā)多發(fā)生在水稻成株期，但部分水稻品種苗期和成株期對褐飛虱的抗性不一致，有些品種是苗期抗蟲、成株期感蟲，而有些品種是苗期感蟲、成株期抗蟲[28]，本研究還需在目前工作的基礎(chǔ)上將獲得的抗褐飛虱改良恢復(fù)系進(jìn)行成株期抗性鑒定，并進(jìn)行持續(xù)和廣泛的測配，以進(jìn)一步明確所獲得改良恢復(fù)系RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH262的褐飛虱抗性表現(xiàn)。

4 結(jié) 論

以分子標(biāo)記輔助選育方法將廣西本土野生稻的優(yōu)良抗褐飛虱基因與恢復(fù)系明恢63進(jìn)行雜交，結(jié)合苗期鑒定，在后代中選育出4個(gè)改良恢復(fù)系RMH-3、RMH-58、RMH-153和RMH262，其褐飛虱抗性表現(xiàn)佳，農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀表現(xiàn)良好，配合力強(qiáng)，可作為配制抗褐飛虱雜交組合的遺傳資源利用。