杜 霞，吳 闊，蘇曉霞，張麗珍，劉 霞，高玉林，張仲凱，楊艷麗*，董家紅*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省植物病理重點實驗室/云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650205；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，北京 100193)

【研究意義】中國2015年啟動了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，馬鈴薯成為繼小麥、水稻、玉米后的第四大主糧。中國是馬鈴薯產(chǎn)量最多的國家，云南省是中國馬鈴薯五大產(chǎn)區(qū)之一，其種植面積和總產(chǎn)量均居全國前四[1]。病害是馬鈴薯生產(chǎn)的重要限制因素，尤其是馬鈴薯病毒病會導(dǎo)致馬鈴薯種薯退化，產(chǎn)量降低，嚴重時減產(chǎn)達50 %以上[2]。通過田間樣品癥狀識別、實驗室RT-PCR、ELISA檢測鑒定病害類型和病原種類，可為病害的準確防控提供依據(jù)[1,3]?！厩叭搜芯窟M展】馬鈴薯A病毒(Potato virus A，PVA virus)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，其病毒粒子是線狀，長約730 nm，直徑15 nm[4]。PVA的基因組是一個正義單鏈RNA分子，長度9.5 kb左右，只包含一個開放閱讀框架(Open reading frame，ORF)，5′-末端共價結(jié)合基因組連接蛋白(Viral genome-linked protein，Vpg)，3′-末端是多聚腺苷酸，其編碼11個成熟功能蛋白，從N端到C端分別是P1蛋白(P1 protein)、HC-Pro酶(Helper component-proteinase)、P3蛋白(P3 protein，)、6K1蛋白(6K1 protein)、CI蛋白(Cylindrical protein)、6K2蛋白(6K2 protein)、Vpg、核內(nèi)含體蛋白a(Nuclear inclusion body a protein，NIa-pro)、核內(nèi)含體蛋白b(Nuclear inclusion body b protein，NIb-pro)和外殼蛋白(Coat protein，CP)[5]。馬鈴薯Y病毒屬中在P3蛋白編碼區(qū)，新發(fā)現(xiàn)第11個蛋白，命名為PIPO[6]，對該蛋白的功能，有研究進行了初步探索，蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus，TuMV)PIPO敲除突變體，僅敲除了PIPO蛋白的表達，但保持TuMV氨基酸序列不改變，該侵染性克隆對煙草不具有侵染性，這對病毒來說是致命的[6]。因此，推斷PIPO可能會影響病毒的致病性[7]。有研究在大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus，SMV)的PIPO不同位點處插入一個或多個終止子，發(fā)現(xiàn)病毒被限制在局部細胞中，但沒有影響病毒復(fù)制，由此推測，PIPO的缺失影響了SMV的細胞間運動[8]。近些年，大量研究報道，P3可能會影響病毒基因組復(fù)制[9]、侵染[10]、細胞間運動以及植株抗性[11]。PVA是馬鈴薯上一類危害比較嚴重的病毒病，2007年P(guān)VA被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》[12]。目前，PVA已在中國云南、浙江、福建、新疆、重慶、湖南、貴州、黑龍江、四川、青海、山西、內(nèi)蒙古、甘肅[13-19]等地發(fā)生，PVA可以通過蚜蟲以非持久性的方式進行傳播，而這些傳播PVA的蚜蟲在中國又比較常見，PVA在中國大規(guī)模流行的風(fēng)險很大，因此要引起重視?！颈狙芯壳腥朦c】用DAS-ELISA方法對云南省不同地區(qū)馬鈴薯樣品進行PVA檢測，對呈陽性的馬鈴薯樣品進行PVA P3蛋白基因的擴增和序列分析，并與國內(nèi)外不同序列進行差異比較?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于不同地區(qū)PVA病毒的基因信息，明確病毒的傳播路徑，為PVA防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 馬鈴薯病樣 取樣方法：各地取2個主栽品種，每個品種選3片田，每片田隨機取5個點，每個點采集5株馬鈴薯的葉片。

分別在云南馬鈴薯的春作種薯區(qū)(2018年5月3日至2018年7月30日)：大理州的洱源縣和劍川縣、迪慶州的香格里拉縣和小中甸鎮(zhèn)、曲靖市的會澤縣和宣威市、昭通市的昭陽區(qū)和魯?shù)榭h、麗江市的玉龍縣；春作商品薯區(qū)(2018年3月5日至2018年6月19日)：大理州的大理市、彌渡縣和南澗縣，曲靖市的羅平縣和陸良縣，昆明市的尋甸縣；冬作區(qū)(2018年1月11日至2018年1月31日)：臨滄市的云縣和雙江縣、大理州的賓川縣、紅河州的開遠市等地共采集389個樣品。馬鈴薯品種主要有合作88、麗薯6號、麗薯7號、宣薯6號、宣薯2號、米拉、青薯9號、青薯7號、云薯505、威芋5號、劍川紅等主栽品種。

1.1.2 儀器與試劑 主要儀器有PCR儀(TaKaRa)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)；高通量微孔洗板機(Elx405)和酶標儀(Elx808)為BioTek公司產(chǎn)品。主要試劑有RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、Taq(5 U/μl)、10×Ex PCR Buffer(20 mmol/L Mg2+Plus)、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞及DL2000 DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒為AXYGEN公司產(chǎn)品；PVA DAS-ELISA試劑盒為Agdia公司產(chǎn)品；牛血清為Solarbio公司產(chǎn)品；底物(4-Nitrophenyl phosphate di(tris) salt)和10 %底物緩沖液(Diethanolamine)均為SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測 采用PVA DAS-ELISA試劑盒進行PVA檢測，步驟如下：在酶標板中加入1∶200包被抗體(Coating Buffer稀釋)，4 ℃包被過夜；以PBST洗板6次后，取待檢測的馬鈴薯樣品約0.2 g研磨后，加入500 μl Coating Buffer緩沖液混勻(1∶30，W/V)，以健康的馬鈴薯葉片作為陰性對照，感病的組培馬鈴薯作為陽性對照，Coating Buffer為空白對照，向已包被的酶標板上加入樣品，每個樣品取100 μl，每個待測樣品2個重復(fù)，37 ℃孵育2 h；PBST洗板6次，向板中每孔加入200 μl含2 %(牛血清：PBS，m/V)牛血清封閉液，37 ℃封閉30 min或4 ℃過夜；甩掉封閉液，將板中每孔加入100 μl效價1∶200的酶聯(lián)抗體(2 %的牛血清稀釋)，37 ℃放置3 h；PBST洗板6次，拍干后，向板中每孔加入1 mg/mL(底物 ℃底物緩沖液，m/V)100 μl顯色液，37 ℃避光放置30 min，酶標儀上讀數(shù)，吸收波長為405 nm。

1.2.2 植物總RNA提取 對2018年在云南省臨滄市的雙江縣(18YV013，2018年1月16日，麗薯6號)，昆明市的尋甸縣(18YV255，2018年6月19日，麗薯6號)、曲靖市的宣威市(18YV262，2018年6月20日，宣薯2號)、昭通市的昭陽區(qū)(18YV267，2018年6月26日，宣薯2號)和大理州的劍川縣(18YV446，2018年7月18日，劍川紅)所采集的經(jīng)ELSIA檢測葉片呈陽性的馬鈴薯樣品采用TRIzol法提取馬鈴薯葉片的總RNA，所得RNA保存于-80 ℃?zhèn)溆?。研磨樣品的研缽需?80 ℃干熱滅菌箱中處理3 h以上。操作步驟如下：用液氮在研缽中充分研磨樣品，取樣品60 mg至1.5 mL離心管中并加入1 mL RNAiso Plus充分混勻后，室溫靜置5 min；加入200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩30 s使溶液至乳白色，室溫孵育5 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；從離心機小心取出離心管，此時勻漿分為3層，即：無色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分DNA)及帶有顏色的下層有機相；吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中(切勿吸出白色中間層)；向上清中加入500 μl異丙醇，上下顛倒充分混勻后，室溫靜置10 min；4 ℃，12 000 r/min離心10 min，一般在離心后，試管底部會出現(xiàn)RNA沉淀；棄掉上清，加入1 mL 75 %乙醇，洗滌，12 000 r/min離心5 min，棄掉上清，重復(fù)1次；自然干燥后，加入適量DEPC水溶解RNA。

1.2.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF977085(China-Hunan)的PVA P3基因全長序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計一對特異性引物，引物如下：PVA-P3-F:5′-GGCACTCCAAATTCTCAGATCAAT-3′;PVA-P3-R:5′-TTGAAACAGAACCACCTCTGCAC-3′。

預(yù)期擴增片段長度是1041 bp，引物由昆明擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄時所用引物初始濃度為100 pmol/L，PCR時所用引物初始濃度為10 pmol/L。

1.2.4 RT-PCR擴增、克隆 cDNA合成參照試劑盒說明書操作。反應(yīng)體系如下：特異性引物 PVA-P3-R 1 μl，dNTPMixture(各2.5 mmol/L)1 μl，RNA 8μl以上為A，將A置于65 ℃，5 min后冰上迅速冷卻；將以下組分加入A中，5×PrimeScriptⅡBuffer 4 μl，RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5 μl，PrimeScriptⅡRtase(200 U/μl)1 μl，RNase free dH2O 4.5 μl，緩慢將其混勻后，46 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。得到的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系：cDNA 3 μl，PVA-P3-F 1 μl，PVA-P3-R 1 μl，10×Buffer(Mg2+) 5 μl，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μl，rTap聚合酶1 μl，加ddH2O至50 μl。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μl PCR擴增產(chǎn)物與1 μl 6×Loading Buffer混勻，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

用DNA膠回收試劑盒回收純化克隆產(chǎn)物，將其與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，用含氨芐青霉素(Ampicillin)抗性LB培養(yǎng)基進行篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR鑒定后送去測序。目的片段的測序工作在昆明擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行。

1.2.5 序列分析 使用BLASTN工具進行序列比對；用DNAStar和DNAMAN等軟件分析序列；采用MEGA 6.0鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。用于序列分析的13個PVA分離物下載自GenBank: AF543212(USA-U clone1-Potato)、AJ131400(Finland-Her-Potato)、AJ131401(Germany-Ali-Potato)、AJ131402(USA-U-Potato)、AJ131403(New Zealand-TamMV-Tamarillo)、AJ296311(Hungary-B11-Potato)、GU144321(UK-143-Potato)、KF977085(China-Hunan-Potato)、KM365067(New Zealand-007-Tamarillo)、KM365068(New Zealand-B14-Tamarillo)、KM365069(New Zealand-LL6-Tamarillo)、KU586450(Peru-GAF318-Potato)、Z21670(USA-M-Potato)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測結(jié)果

用Agdia公司的PVA DAS-ELISA試劑盒檢測云南省19個縣(市)的389個馬鈴薯樣品，PVA的陽性檢出率為20.82 %；其中檢測主栽品種宣薯2號30個樣品，陽性率為50.00 %，麗薯6號的110個樣品陽性率為21.82 %，合作88的53個樣品陽性率為18.87 %、9個劍川紅樣品均為陽性(表1)。

表1 云南省389個馬鈴薯樣品的ELISA檢測Table 1 ELISA detection of 389 potato samples from Yunnan province

續(xù)表1 Continued table 1

2.2 PVA P3蛋白基因RT-PCR擴增、克隆、測序

以ELISA檢測呈陽性的馬鈴薯葉片所提的總RNA為模板，PVA-P3-F和PVA-P3-R為引物進行反轉(zhuǎn)錄和擴增(圖1)、克隆及測序，用DNAMAN軟件分析獲得1041bp的特異性片段，其產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。

2.3 云南省不同地區(qū)PVA分離物之間P3及PIPO蛋白序列分析

用DNAStar軟件分析云南省5個不同地區(qū)PVA分離物之間的P3蛋白基因和PIPO蛋白基因的核苷酸序列及氨基酸序列的同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南省5個地區(qū)PVA分離物之間P3蛋白基因的核苷酸序列的同源性為98.7 %～99.6 %；推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為98.8 %～99.7 %。

M：DL2000 DNA Marker；1：陰性；2：18YV013；3：18YV255；4：18YV262；5：18YV267；6：18YV446M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative; 2: 18YV013; 3: 18YV255; 4: 18YV262; 5: 18YV267; 6: 18YV446圖1 云南省5個PVA分離物P3基因擴增Fig.1 P3 protein gene amplification of 5 PVA Yunnan isolates

PIPO蛋白基因的核苷酸序列同源性為99.2 %～100.0 %，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為97.6 %～100.0 %。

2.4 云南省和其他已報道的PVA分離物的P3蛋白及PIPO蛋白序列同源性分析

用DNAStar軟件分析云南省5個分離物(18YV013、18YV255、18YV262、18YV267及18YV446)，與GenBank中的13個已發(fā)表的PVA P3蛋白基因之間的同源性，發(fā)現(xiàn)云南省分離物與湖南省分離物China-Hunan具有最高的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分別為99.2 %和99.1 %；其次是秘魯分離物Peru-GAF318，核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性分別為98.9 %和99.1 %。與新西蘭樹番茄(Solanumbetaceum)4個分離物(New Zealand-007、New Zealand-B14、New Zealand-LL6和New Zealand-TamMV)的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最低，分別為84.5 %～99.2 %和90.8 %～97.4 %。用軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)來自世界各地的PVA主要分為2個大組，其中新西蘭樹番茄的3個分離物(New Zealand-007、New Zealand-LL6和New Zealand-TamMV)成一組，其余馬鈴薯分離物與新西蘭樹番茄分離物New Zealand-B14成一組，在馬鈴薯分離物組中，中國的6個PVA分離物聚為一個亞分支，他們之間具有最近的親緣關(guān)系(圖2)。

表2 云南省5個PVA分離物和其他已報道的13個PVA分離物的P3蛋白基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸同源性分析Table 2 Nucleotide and putative amino acid sequenceidentitiesof P3 protein gene between Yunnan 5 PVA isolatesand other reported13 PVA isolates

注：nt 表示核苷酸序列，aa表示氨基酸序列,下同。

Notes：nt is nucleotide suquence,aa is amino acid sequence.The same as below.

表3 云南省5個PVA分離物和其他已報道的13個PVA分離物的PIPO蛋白基因的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸同源性分析Table 3 Nucleotide and putative amino acid sequence identities of PIPO protein gene between Yunnan 5 PVA isolatesand other reported13 PVA isolates

用DNAStar軟件分析云南省5個分離物(18YV013、18YV255、18YV262、18YV267及18YV446)與GenBank中的13個已發(fā)表的PVA PIPO蛋白基因之間的同源性，相比P3蛋白之間的親緣關(guān)系，PIPO間具有更高的同源性。14個馬鈴薯分離物之間的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為98.0 %～99.6 %、96.4 %～100.0 %；而云南省5個分離物之間的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為99.2 %～100.0 %、97.6 %～100 %；分離自昆明尋甸、昭通昭陽、大理劍川、臨滄雙江與其余PVA馬鈴薯分離物具有更近的親緣關(guān)系，而分離自曲靖宣威的分離物獨立為一分支(圖3)。

3 討 論

為了解馬鈴薯A病毒在云南省的發(fā)生情況，于2018年通過云南省農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化馬鈴薯產(chǎn)業(yè)體系各試驗站分別針對云南種薯繁育、春作區(qū)、冬作區(qū)馬鈴薯進行調(diào)查取樣，對各樣品進行了ELISA檢測，PVA檢出率為20.82 %，其中迪慶、麗江、大理、昭通、宣威等種薯繁育帶毒率為27.70 %，主要感染的品種是麗薯6號，感染率為7.98 %；曲靖的羅平、陸良和昆明等春作區(qū)帶毒率為21.05 %，主要感染的品種是麗薯6號和宣薯2號，感染率均為4.64 %；臨滄、開遠等冬作區(qū)的帶毒率為19.70 %，主要感染的品種是麗薯6號，感染率為13.64 %。PVA在云南馬鈴薯上發(fā)生較為普遍，但在田間調(diào)查時，馬鈴薯植株上癥狀表現(xiàn)不明顯，絕大部分為無癥，并沒有引起更多關(guān)注，對馬鈴薯產(chǎn)量、品質(zhì)的影響也需要開展更多研究。

文獻報道，馬鈴薯Y病毒屬P3蛋白有可能影響病毒基因組復(fù)制、侵染、細胞間運動以及植株抗性。PVA 的P3蛋白與NIb相關(guān)，參與病毒的復(fù)制，P3是馬鈴薯Y病毒屬中變異性最大的部分，推測與其在病毒?；瓦M化過程扮演重要的角色相關(guān)，P3可能是致病性決定性的因素之一[20]。P3還是決定寄主抗性的主要因子[11]。P3序列的變化會影響其編碼的氨基酸序列的變化，導(dǎo)致其功能產(chǎn)生較大的變化，影響病毒的復(fù)制、侵染，對植物的產(chǎn)生的影響也會隨之變化。PIPO是包含在P3序列中的一部分，是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白，對其功能還并不是很明確，但有文獻報道，PIPO會影響病毒的致病性和病毒在細胞間的運動。為了確定云南不同地區(qū)PVA親緣關(guān)系，設(shè)計了PVA的P3特異性引物對云南5個地區(qū)(昆明市的尋甸縣、宣威市的寶山鎮(zhèn)、昭通市的昭陽區(qū)、大理州的劍川縣和臨滄市的雙江縣)的3個品種(麗薯6號、宣薯2號和劍川紅)上的5個分離物進行序列擴增、克隆、測序分析。5個云南省PVA分離物與國內(nèi)外其它地區(qū)分離物的13個PVA分離物的同源性的相互比較，發(fā)現(xiàn)侵染云南省馬鈴薯的PVA之間親緣關(guān)系較近，云南省與湖南省馬鈴薯PVA分離物親緣關(guān)系最近，云南省5個PVA分離物之間變異不大(P3變異度0.3～1.2，PIPO變異度0.0～2.4)；與其它地區(qū)馬鈴薯分離物的變異也不大(P3變異度0.9～2.3，PIPO變異度0.0～3.7)；但與新西蘭樹番茄分離物的變異均較大(P3變異度2.6～9.9，PIPO變異度0.0～10.2)，顯示PVA具有寄主適應(yīng)性。云南省5個地區(qū)的PVA之間存在一定的變異性，但是差異不大，推測其來源于同一個PVA分離株?；?8個PVA的P3和PIPO氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹也表明馬鈴薯分離的PVA較樹番茄上分離的PVA有較近的親緣關(guān)系，也表現(xiàn)出一定的地域相關(guān)性。

圖2 根據(jù)PVA P3蛋白基因的氨基酸序列構(gòu)建5個云南省PVA分離物與其他已報道的PVA分離物之間的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on animo acid sequences of P3 proteingene of Yunnan 5 PVA isolates and other reported 13 PVA isolates

通過對PVA的P3和PIPO分析，可以為PVA的防控及其的分布、傳播，變異與進化分析提供理論依據(jù)，對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

4 結(jié) 論

PVA在云南省的危害較為普遍，研究明確了云南省5個地區(qū)PVA的P3蛋白序列和PIPO蛋白序列，以及云南省不同地區(qū)分離物之間有較近的親緣關(guān)系，表現(xiàn)一定的地域相關(guān)性。通過同源一致性分析，明確了云南省5個地區(qū)的PVA之間存在一定的變異性，但是差異不大。通過進化樹分析，5個地區(qū)的PVA遺傳變異和地理來源存在一定的相關(guān)性。

用煙草葉脈斑點病毒 (TVMV)作為組外的根Tobacoo vein mottling virus (TVMV) was regarded as root outside the group圖3 根據(jù)PIPO蛋白基因的氨基酸序列構(gòu)建云南省5個分離物與其他已報道的分離物之間的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on animo acid sequences of PIPO proteingene of Yunnan 5 PVA isolates and other reported 13 PVA isolates