甄軍波，劉琳琳，杜海英，劉 迪，蔡 肖，張建宏，遲吉娜

(河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051)

【研究意義】棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉籽油也是大豆、油菜、向日葵和花生之外重要的油料來源之一[1]，利用棉籽油開發(fā)生物柴油，既能提高棉籽的綜合利用率，又能實(shí)現(xiàn)能源的可再生，降低對化石能源的依賴，從而保護(hù)生態(tài)環(huán)境。甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)是植物三酰甘油類合成過程中的限速酶，相比于其他作物，棉花GPAT基因的研究相對較少，發(fā)掘棉花GPAT基因，對于深入解析棉籽油合成機(jī)理、提供棉籽含油量具有十分重要的意義[2-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)是植物生物膜中磷脂酰甘油(PG)生物合成過程中的第一個(gè)?；セ?，是Kennedy途徑的第一步，被認(rèn)為是TAG生物合成的“閥門”，其對底物的選擇性對決定PG分子中的不飽和程度起著關(guān)鍵性作用，與種子油份關(guān)系密切[6]。張楠[7]和朱雙[8]等分別從小桐子中克隆了GPAT基因，分別命名為JcGPAT和JcGPAT2。擬南芥中鑒定了10個(gè)GPAT基因，包含AtGPAT1-9和AtATS1。AtATS1定位于質(zhì)體，AtGPAT1-3定位于線粒體膜，AtGPAT4-9則定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[2]。AtGPAT1在擬南芥花粉管發(fā)育中發(fā)揮重要作用[9]。Men等[10]研究表明，OsGPAT3與水稻的花粉管發(fā)育和育性有關(guān)，并推測GPAT3基因在單子葉和雙子葉植物中發(fā)揮的作用不盡相同。Sui等[11]將堿蓬的SsGPAT基因轉(zhuǎn)化擬南芥，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，通過增加擬南芥不飽和脂肪酸含量，從而降低了高鹽脅迫對于光合系統(tǒng)的影響?？匆?，GPAT家族基因在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，有必要進(jìn)一步深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究從海島棉中同源克隆獲得一個(gè)新的GPAT基因，命名為GbGPAT2(登陸號為：KC292646)，對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測了該基因在幼胚發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)特異性，并在煙草中對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行了驗(yàn)證。【擬解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步研究GbGPAT2在棉花中的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 用于目的基因克隆的海資8號(海島棉)為河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所分子設(shè)計(jì)育種研究室提供，種植于河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)地。種子置于黑暗培養(yǎng)箱中，經(jīng)12 ℃處理8 h，恢復(fù)25 ℃正常條件培養(yǎng)，取正在萌發(fā)的種子，立即放于液氮中，備用；分別取開花后16、25、30、35 d 的胚，液氮速凍，用于檢測GbGPAT2的表達(dá)量。

1.1.2 質(zhì)粒、菌種與試劑 克隆載體pT-Easy Vector、Premix ExTaq、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TransGen公司；植物總RNA提取試劑盒購自北京奧萊博生物有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 總mRNA 提取和反轉(zhuǎn)錄

采用北京奧萊博生物有限公司Plant RNA Kit 提取棉花種子和未成熟胚的總RNA，具體方法參照試劑盒說明書。采用TransGen反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3 GbGPAT2基因的克隆

以蓖麻ACB30456.1氨基酸序列提交NCBI，獲得棉花EST，通過DNAMAN 軟件拼接序列，獲得電子克隆片段。利用Primer5設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因全長，引物序列為：GPAT-S: ATGAACAGTAGTGAAGGGAAGTTGAAATCA，GPAT-A: TCATTTTTCTTCCAGTTCCAGTCCCCG，引物由Invitrogen公司合成。以cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR 程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min， 94 ℃ 1 min， 55 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min 30 s, 共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 保溫。將PCR產(chǎn)物在含Goldview的1.0 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，電泳30 min后，置于Biored凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。用DNA分子量Marker DL2000判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小。以瓊脂糖凝膠分離純化試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到pT-EASY載體上，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TransT3。經(jīng)菌落培養(yǎng)和藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑取8個(gè)克隆進(jìn)行PCR 陽性驗(yàn)證，將獲得的3個(gè)陽性單克隆送Invitrogen公司測序。單克隆序列通過NCBI比對，確定克隆序列為目的基因，提交NCBI的ORF finder預(yù)測其開放閱讀框，并經(jīng)BLASTX同源比對驗(yàn)證。

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

用NCBI (http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的BLAST、ORF及ExPASY (http://expasy.org/tools/)中的ComputepI/Mw tool 等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過NCBI CDD數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Databases), 進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析；采用ProtParam (http://expasy.org/tools /protparam.html) 進(jìn)行氨基酸基本理化性質(zhì)分析；利用Predictprotein (http://www.predictprotein. org/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分別預(yù)測跨膜區(qū)、功能位點(diǎn)和信號肽；蛋白質(zhì)的疏水性由ProtScale tool (http://expasy.org/tools/pscale/Hphob.Woods.html)預(yù)測。以GbGPAT2作為查詢母序列，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索與該基因同源的其他物種的氨基酸序列，通過ClustalX軟件進(jìn)行氨基酸序列比對，采用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 qRT-PCR檢測胚發(fā)育過程中的表達(dá)特異性分析

選取基因特異性較高的序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，qG1：GTGTTTTAAGTCGAATCCCCCG；qG2：CCCTCTCCATCTTTTTCCGCAA。選取開花后16、25、30、35 d的胚，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在德國耶拿熒光定量PCR儀中檢測該基因的表達(dá)模式，以組成型表達(dá)的泛素基因Ubiquitin7作為內(nèi)參，PCR程序?yàn)? 95 ℃ 2 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 GbGPAT2氨基酸組成分析Table 1 Composition of the amino acids in GbGPAT2

1.6 GbGPAT2基因的亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)引物GbGPAT2-F和GbGPAT2-R，將GhbHLH開放閱讀框連接至亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA1302，挑取單克隆測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，空載體pCAMBIA1302作為對照，農(nóng)桿菌菌液注射煙草葉肉細(xì)胞，黑暗過夜培養(yǎng)后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細(xì)胞定位結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GbGPAT2 全長序列克隆

根據(jù)特異引物在cDNA中的擴(kuò)增，獲得約1300 bp左右片段(圖1)，經(jīng)克隆后測序，發(fā)現(xiàn)GbGPAT2基因序列全長為1294 bp，包含 1 個(gè)1113 bp 的開放閱讀框，編碼370 個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測分子量為42.4 kD，等電點(diǎn)為8.72，5′端非翻譯區(qū)長40 bp，3′端非翻譯區(qū)長141 bp。氨基酸組成成分中，極性氨基酸占24.05 %，疏水性氨基酸占37.57 %(表1)，在GenBank中登錄號為KC292646。

2.2 GbGPAT2的功能結(jié)構(gòu)域分析

用NCBI的Conserved Domains程序預(yù)測蛋白的保守區(qū)，發(fā)現(xiàn)本研究克隆的基因編碼的蛋白是溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶 (LPLAT-LPCAT1-like) 超家族成員(圖2)，該基因編碼的蛋白具有一個(gè)典型的溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶相似家族保守區(qū)(LPLAT-LPCAT1-like)和?；D(zhuǎn)移酶超家族保守結(jié)構(gòu)域(NAT-SF superfamily)。

M: D2000; 1: GbGPAT2圖1 海島棉GbGPAT2同源基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of GbGPAT2 homology in Gossypium barbadense

2.3 GbGPAT2與其他植物GPAT氨基酸序列多重比對

用BLASTX同源分析顯示，海島棉GbGPAT2氨基酸序列與其他植物GPAT具有較高的同源性(圖3)。GbGPAT2與小桐子、擬南芥GPAT氨基酸序列同源性在87 %～92 %，而與已公開的陸地棉GhGPAT氨基酸序列同源性只有8 %。GbGPAT2編碼的氨基酸有4個(gè)序列保守區(qū)域，其中motif-1的組氨酸(H)和天冬氨酸(D)殘基、motif-3的甘氨酸(G)殘基、motif-4的脯氨酸(P)殘基都高度保守，被認(rèn)為是?；D(zhuǎn)移酶家族中重要的催化位點(diǎn)[12]。motif-2的苯丙氨酸(F)和精氨酸(R)以及motif-3中的絲氨酸(S)，在甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶的底物結(jié)合中起重要作用[13]。

2.4 GbGPAT2編碼蛋白的跨膜區(qū)分析

通過在線的親/疏水性分析(http://cn.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)，發(fā)現(xiàn)GbGPAT2的N端肽鏈存在一定范圍的疏水區(qū)(圖5，0以上的區(qū)段為疏水區(qū))，而其他部分則存在較大范圍的親水區(qū)，有較強(qiáng)的親水性(圖4A)。進(jìn)而通過在線的TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對編碼蛋白跨膜區(qū)進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)GbGPAT2具有2個(gè)顯著的跨膜區(qū)，分別在第92～144氨基酸處和第127～144氨基酸處(圖4B)。

圖2 GbGPAT2 氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domain of GbGPAT2

黑線標(biāo)示區(qū)域依次為GPAT保守域1-4 圖3 不同植物GPAT蛋白保守區(qū)的多序列分析Fig.3 Alignment of deduced amino acid of GPATs from different plants

2.5 GbGPAT2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn)GbGPAT2編碼的肽鏈含36.4 %的α-螺旋，38.3 %的β-折疊，15.1 %的轉(zhuǎn)角構(gòu)象，10.5 %的無規(guī)則卷曲(圖5)。

圖4 GbGPAT2疏水性和跨膜區(qū)預(yù)測Fig.4 Prediction of hydrophobicity and trans-membrane region of the GbGPAT2 amino acid sequence

圖5 GbGPAT2氨基酸序列DNASTAR-Protein分析結(jié)果Fig.5 Result of GbGPAT2 amino acid sequence analyzed by DNAStar-Protein programe

圖6 GbGPAT2與其他物種GPATs氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree analysis of GPATs amino acids

2.6 GbGPAT2同其他物種的進(jìn)化關(guān)系分析

構(gòu)建陸地棉、擬南芥和小桐子等植物的GPAT氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)GbGPAT2在分化時(shí)間上較晚，能與小桐子的JcGPAT和擬南芥的AtGPAT9親緣關(guān)系較近，而與陸地棉已有的GPAT進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

2.7 GbGPAT2在幼胚中的表達(dá)模式

在種子形成的胚發(fā)育的不同階段，選取16 DPA、25 DPA、30 DPA、35 DPA胚，提取RNA，利用GbGPAT23′-UTR區(qū)特異引物，以組成型表達(dá)的泛素基因Ubiquitin7作為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR檢測了其表達(dá)特異性(圖7)。結(jié)果表明，GbGPAT2在胚發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)豐度不同，在開花后25 d 的胚中表達(dá)量最大，隨著胚發(fā)育的逐漸成熟，GbGPAT2表達(dá)量逐漸下降。

2.8 GbGPAT2亞細(xì)胞定位

為了驗(yàn)證GbGPAT2的亞細(xì)胞定位信息，本研究構(gòu)建了pCAMBIA1302-GbGPAT2-GFP融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌將空載體和融合載體轉(zhuǎn)化煙草葉肉細(xì)胞，暗培養(yǎng)后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況，結(jié)果表明，GbGPAT2定位于細(xì)胞質(zhì)膜中(圖8)，與預(yù)測結(jié)果一致。

3 討 論

研究表明，在植物細(xì)胞中GPAT主要存在于質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等部位，其中定位于質(zhì)體中的GPAT是可溶性蛋白，以acyl-ACP為底物進(jìn)行催化反應(yīng)，而定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的則是結(jié)合蛋白，以acyl-CoA和acyl-ACP為底物[14]。本研究中從海島棉中克隆了GbGPAT2基因，該基因開放閱讀框全長1113 bp，在棉花胚發(fā)育25 d表達(dá)量最高，在煙草中的亞細(xì)胞定位表明，該基因定位于細(xì)胞質(zhì)膜之中。

由于GPAT在sn-1和sn-2進(jìn)行催化反應(yīng)的偏好性不同，即使屬于同一亞組，GPAT也可能發(fā)揮不完全相同的作用[10,15]。在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10個(gè)AtGPAT基因(AtGPAT1-9和ATS)，其中AtGPAT8和AtGPAT9同源，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，有著相似的功能，在Kennedy途徑中控制TAG的生物合成[2]。

橫坐標(biāo)為胚不同的發(fā)育時(shí)期(16DPA、25DPA、30DPA、35DPA)，縱坐標(biāo)為相對表達(dá)量圖7 GbGPAT2在胚發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)特異性分析Fig.7 Real-time PCR of GbGPAT2 in different times of embryo development

圖8 GbGPAT2亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of GbGPAT2

GPAT在植物脂類代謝中功能多樣，不但參與TAG的合成，而且涉及膜脂的生物合成和植物的抗性[12-14]。國內(nèi)外研究者已經(jīng)從已先后從小桐子[7-8]、擬南芥[9]、番茄[13]、甜辣椒[16]、豌豆[17]等多種植物中克隆到了GPAT基因。將擬南芥和菠菜的GPAT基因分別轉(zhuǎn)入水稻中，使水稻葉片中磷酸甘油的順式不飽和脂肪酸含量得到了顯著提高[18]。在擬南芥中過表達(dá)GPAT基因能夠顯著提高種子含油量[14,19]，擬南芥AtGPAT5在種皮和根中優(yōu)勢表達(dá)，對于擬南芥軟木脂等聚酯類物質(zhì)的合成以及脂類聚合物的結(jié)構(gòu)都具有重要作用[20]。構(gòu)建的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，GbGPAT2與擬南芥AtGPAT9和小桐子JcGPAT(HQ395225)基因的親緣關(guān)系較近，同樣具有高度保守的motif 1-4，以及對應(yīng)的氨基酸殘基，推測GbGPAT2基因可能與擬南芥AtGPAT8、AtGPAT9和小桐子的JcGPAT具有類似的功能。本研究克隆的GbGPAT2可能參與脂類代謝，在提高種子油含量方面發(fā)揮著重要的作用，具體功能如何有待于進(jìn)一步的研究。