謝瑜杰,陳 輝,胡雪艷,劉志楠,范春林,呼秀智,彭 濤,*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲 056021)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZON)又稱(chēng)F-2毒素,是由鐮刀菌屬產(chǎn)生一種毒素,廣泛存在于飼料和農(nóng)產(chǎn)品等基質(zhì)中,尤其在潮濕地區(qū),玉米赤霉烯酮更易存在于農(nóng)產(chǎn)品等基質(zhì)中[1-2]。該毒素具有弱的雌激素作用,人和動(dòng)物攝入被玉米赤霉烯酮污染的食物或飼料后會(huì)造成生殖系統(tǒng)機(jī)能紊亂,且經(jīng)胃腸道消化后可代謝產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的代謝物(代謝途徑見(jiàn)圖1),嚴(yán)重時(shí)可能造成死亡[2-4]。排出體外的玉米赤霉烯酮通過(guò)水和食物會(huì)造成第二次污染,人食用后會(huì)抑制促性腺激素結(jié)合受體,影響人體性機(jī)能及第二性征,在外部條件誘導(dǎo)下還會(huì)致癌[5-6]。研究發(fā)現(xiàn),該毒素可通過(guò)血-乳屏障進(jìn)入到牛乳中,導(dǎo)致乳及乳制品中會(huì)有玉米赤霉烯酮的殘留[7-8]。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活水平的提高,乳及乳制品已成為居民獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來(lái)源,而奶粉作為嬰幼兒等免疫力低下人群營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源,其質(zhì)量安全問(wèn)題更應(yīng)被重視,尤其對(duì)于玉米赤霉烯酮等對(duì)人體危害極大的真菌毒素的污染。

圖1 玉米赤霉烯酮在體內(nèi)代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of zearalenone in vivo

由于玉米赤霉烯酮具有毒性,我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量(GB 2761-2017)[9]中規(guī)定玉米赤霉烯酮在小麥等谷物及其制品中限量指標(biāo)≤60 μg/kg,但并沒(méi)有相關(guān)組織對(duì)奶粉中玉米赤霉烯酮的殘留限量制定相關(guān)規(guī)定。因此,為了保障消費(fèi)者食用產(chǎn)品的安全及個(gè)人健康,研究建立能夠簡(jiǎn)單、快速、靈敏、高效地檢測(cè)奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的方法就顯得尤為重要。針對(duì)檢測(cè)食品中玉米赤霉烯酮的方法很多,如ELISA[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]、高效液相色譜法[12]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。目前主要采用的是高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、穩(wěn)定可靠、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì),使其成為檢測(cè)玉米赤霉烯酮的常用檢測(cè)方法[13-14]。截至目前,HPLC-MS/MS常用來(lái)檢測(cè)糧油和谷物中玉米赤霉烯酮及其代謝物[15-19],很少應(yīng)用于嬰幼兒食品的檢測(cè),其中Z?llner等[17]使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)早餐谷物和嬰兒食品中玉米赤霉烯酮等真菌毒素,其中玉米赤霉烯酮的檢出限是10 μg/kg。但使用HPLC-MS/MS檢測(cè)奶粉中的玉米赤霉烯酮及其代謝物目前尚未報(bào)道。

目前,用于奶粉中獸藥及激素殘留的凈化方法主要有固相萃取柱凈化[20-21]、磁性多壁碳納米管分散固相萃取[22]、分子印跡固相萃取[23-24]等,這些傳統(tǒng)方法在凈化技術(shù)上有選擇性好,抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn),但與QuEChERS凈化方法相比,存在操作繁瑣且耗費(fèi)高的缺點(diǎn)。近年來(lái),改進(jìn)和優(yōu)化后的QuEChERS方法應(yīng)用在多種基質(zhì)的農(nóng)獸藥及真菌毒素的殘留檢測(cè)中[25-26],但針對(duì)凈化奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物并未見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的分析方法進(jìn)行研究。為了更好地提取目標(biāo)物,本研究在加入提取液前先加入適量的水增加分散性,使用乙酸鈉作為鹽析劑,促使目標(biāo)物更好地提取。此外,對(duì)傳統(tǒng)的QuEChERS方法進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。建立了改進(jìn)的QuEChERS凈化結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的方法,并對(duì)該方法的檢出限、定量限、精密度、基質(zhì)效應(yīng)和回收率進(jìn)行了驗(yàn)證。方法簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,結(jié)果可靠準(zhǔn)確,可以為準(zhǔn)確快速檢測(cè)奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奶粉諾優(yōu)能 物美超市購(gòu)買(mǎi);α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、β-玉米赤霉烯醇-d7標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L) 德國(guó)Dr.E公司,純度≥97%;乙腈色譜純、正己烷色譜純、乙酸質(zhì)譜級(jí) Fisher公司;乙酸銨色譜純 Acros Organics 公司;C1850 μm 天津博納艾杰爾公司;氧化鋯包覆硅膠(Z-Sep) Sigma-Aldrich公司;N-丙基乙二胺(PSA) 40～60 μm,天津博納艾杰爾公司;實(shí)驗(yàn)用水 為Milli-Q超純水;其它未做說(shuō)明的試劑 均為分析純。

Agilent 1290高效液相色譜儀和Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫公司;TRIO TM-1 N型漩渦混合器 AS ONE公司;SR-2DS型水平振蕩器 TATEC公司;3-30 K型高速冷凍離心機(jī) Sigma公司;N-EVAP 112型氮吹儀 Organomation Associates公司;Milli-Q超純水儀 Millipore公司;KQ-600B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 精確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品0.01(精確至0.0005 g),分別置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃冰箱保存。需要時(shí)各取儲(chǔ)備液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中,并用甲醇稀釋成10 mg/L的混合中間液,使用前將中間液用甲醇稀釋配制成1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液。配制好的溶液均避光、4 ℃下保存。

β-玉米赤霉烯醇-d7標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L)內(nèi)標(biāo)溶液(甲醇中)在使用前稀釋至1 mg/L。

1.2.2 奶粉中玉米赤霉烯酮類(lèi)化合物提取 準(zhǔn)確稱(chēng)5.00 g奶粉樣品(超市購(gòu)買(mǎi))置于50 mL離心管中,加入1 mg/L內(nèi)標(biāo)20 μL,渦旋20 s,靜置20 min,加入10 mL超純水渦旋混勻,再分別加入10 mL 1%乙酸乙腈和2 g乙酸鈉,快速搖勻,渦旋1 min,10000 r/min離心10 min,取上清液于50 mL離心管中。用1%乙酸乙腈重復(fù)提取1次,合并上清液。

1.2.3 除脂 將1.2.3的提取液加入乙腈飽和正己烷10 mL,渦旋20 s,10000 r/min離心5 min,棄上層正己烷,用1%乙酸乙腈定容至20 mL,待凈化。

1.2.4 凈化 將1.2.4溶液取10 mL轉(zhuǎn)移至裝有60 mg C18、60 mg PSA、100 mg無(wú)水硫酸鎂的15 mL離心管中,水平振蕩10 min,10000 r/min離心10 min,取上清液于另一試管中,在40 ℃下氮吹至干,以1 mL水-乙腈(3+1,v/v)定容,過(guò)0.22 μm濾膜后,供HPLC-MS/MS分析。

1.2.5 測(cè)定條件

1.2.5.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,3.5 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:A為5 mmol/L NH4Ac溶液,B為乙腈溶液;洗脫梯度:0～5 min,25%～70% B,5～6 min,70% B;6～9 min,70%～25% B。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);毛細(xì)管電壓;4.0 kV;源溫度:350 ℃;去溶劑氣流:氮?dú)?10 L/min;去溶劑溫度:325 ℃;錐孔氣流:氮?dú)?8 L/min;碰撞氣壓:氮?dú)?0.4 MPa。其他參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 玉米赤霉烯酮及其代謝物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrumparamenters for zearalenone and its metabolites

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果采用形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的優(yōu)化

稱(chēng)取5 g樣品,在10 μg/kg添加濃度下,加入10 mL水及10 mL提取液與直接加入10 mL提取液的回收率進(jìn)行對(duì)比。發(fā)現(xiàn)直接加入提取液的樣品回收率除β-玉米赤霉醇外,其他目標(biāo)物均低于70%,而水化后所有目標(biāo)物均有明顯提高,均高于80%,如圖2所示?？紤]其原因?yàn)槟谭凼且环N干粉樣基質(zhì),同時(shí)具有一定的水溶性,為了能將奶粉中目標(biāo)物更完全地提取出來(lái),本實(shí)驗(yàn)選擇在加入提取液前加入適量的水,以增加分散性,提高玉米赤霉烯酮及其代謝物的提取效率[27]。

圖2 在10 μg/kg添加濃度下水化對(duì)玉米赤霉烯酮及其代謝物回收率的影響Fig.2 Effect of hydration on recovery of ZERs at 10 μg/kg concentration

奶粉屬于高脂、高蛋白樣品。研究表明,乙腈具有沉淀蛋白的作用[28],同時(shí),玉米赤霉烯酮及其代謝物呈弱酸性,在酸性條件下易于有機(jī)溶劑提取,且根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)牛奶中玉米赤霉烯酮類(lèi)毒素,發(fā)現(xiàn)使用1%乙酸乙腈作為提取液提取效果最好[29],回收率在70%～120%之間,因此,本實(shí)驗(yàn)選擇1%乙酸乙腈作為提取奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的提取液。

2.2 凈化方法的優(yōu)化

鑒于玉米赤霉烯酮及其代謝物在食品中含量甚微,但干擾物質(zhì)甚多,因此凈化便成為去除干擾物的關(guān)鍵步驟[30]。一般凈化方式主要有固相萃取、免疫親和柱凈化、液-液分配、基質(zhì)分散固相萃取等技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)選擇使用液-液分配和QuEChERS兩步凈化方法消除奶粉中干擾物質(zhì)的影響。

首先使用乙腈飽和正己烷去除奶粉中大部分脂肪。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了乙腈飽和正己烷的使用次數(shù),在提取液與乙腈飽和正己烷體積相同的情況下,發(fā)現(xiàn)隨著乙腈飽和正己烷的使用次數(shù)的增多,凈化效果越好,但是目標(biāo)化合物的回收率也會(huì)隨之降低,為了兼顧凈化效果以及回收率,本實(shí)驗(yàn)選擇使用一次乙腈飽和正己烷除脂。

其次,采用QuEChERS方法對(duì)除脂后的提取液進(jìn)一步凈化。常見(jiàn)的吸附劑中,C18可去除基質(zhì)中的脂肪和酯類(lèi)等[29],Z-Sep常被用于去除高脂肪蔬菜產(chǎn)品的提取物[31],PSA常用于去除脂肪酸、糖等極性物質(zhì)[29],無(wú)水硫酸鎂主要用來(lái)去除提取液中殘留的水分[29]。本實(shí)驗(yàn)將10 mL提取液倒入裝有吸附劑的15 mL塑料離心管中。吸附劑選擇使用60 mg C18或60 mg Z-Sep分別結(jié)合60 mg PSA、100 mg無(wú)水硫酸鎂在10 μg/kg添加濃度下進(jìn)行對(duì)比,如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在相同質(zhì)量的PSA和無(wú)水硫酸鎂的條件下,C18對(duì)目標(biāo)物凈化后的回收率影響較小,除β-ZOL外,其余目標(biāo)物的回收率均高于80%,而使用Z-Sep凈化后,除β-ZOL外,其余化合物的回收率均低于C18的凈化結(jié)果,尤其是α-ZAL和ZON回收率僅有60%。因此本實(shí)驗(yàn)選擇C18、PSA、無(wú)水硫酸鎂三種吸附劑作為研究對(duì)象。

圖3 在10 μg/kg添加濃度下C18和Z-Sep對(duì)玉米赤霉烯酮及其代謝物回收率的影響Fig.3 Effecting of C18 and Z-Sep on the recovery of ZERs at 10 μg/kg conteration

本文在10 μg/kg添加水平下對(duì)C18、PSA和無(wú)水硫酸鎂的用量進(jìn)行優(yōu)化。選擇200 mg C18和無(wú)水硫酸鎂,分別使用40、60、80、100、150、200 mg的PSA對(duì)提取液進(jìn)行凈化,根據(jù)凈化效果和凈化后的回收率選取最佳的凈化填料比例。圖4(a)給出了PSA用量變化時(shí)6種目標(biāo)物回收率的變化情況,當(dāng)PSA用量為40 mg時(shí),6種目標(biāo)物的回收率相對(duì)較低,用量在80～200 mg時(shí),除α-ZAL,α-ZOL,β-ZAL外,其余三種目標(biāo)化合物的回收率隨著用量的增多而上升,且RSD值也隨之增大,而使用60 mg PSA時(shí)回收率和重復(fù)性結(jié)果均較其他用量時(shí)效果好;

當(dāng)PSA用量為60 mg,無(wú)水硫酸鎂用量為200 mg的時(shí)候,分別使用40、60、80、100、150、200 mg的C18對(duì)提取液進(jìn)行凈化,圖4(b)給出了C18用量對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響,可以看出當(dāng)用量為60 mg時(shí),除α-ZAL和β-ZAL外,其余4種目標(biāo)物的回收率優(yōu)于其他條件;

當(dāng)PSA和C18用量均為60 mg時(shí),分別使用40、60、80、100、150、200 mg的PSA對(duì)提取液進(jìn)行凈化,根據(jù)目標(biāo)化合物的回收率及RSD,如圖4(c)所示,當(dāng)無(wú)水硫酸鎂用量為100 mg時(shí),除α-ZOL,β-ZOL和ZAN外,其余3種目標(biāo)物的回收率和RSD最好。凈化效果如圖5所示,在最佳凈化填料比例下,6種目標(biāo)物在0.2 μg/kg添加濃度下,目標(biāo)化合物的出峰位置無(wú)雜峰出現(xiàn)。因此,本文選擇的吸附劑比例為C18+PSA+無(wú)水硫酸鎂(60 mg+60 mg+100 mg)。

圖4 在10 μg/kg添加濃度下吸附劑對(duì)回收率的影響Fig.4 Effec of adsorbent on the recovery at 10 μg/kg conteration注:a:PSA對(duì)回收率的影響;b:C18對(duì)回收率的影響;C:無(wú)水硫酸鎂對(duì)回收率的影響。

圖5 奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物TIC圖Fig.5 TIC diagram of ZERs in milk powder注:1:β-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇2:α-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、玉米赤霉酮;3:玉米赤霉烯酮。

2.3 色譜條件的選擇

結(jié)合前期研究結(jié)果[26],發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮及其代謝物在C18色譜柱上可以很好的保留,因此本實(shí)驗(yàn)選擇在ZORBAX SB-C18柱上分離。有研究報(bào)道,乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí),可以減少基質(zhì)干擾和提高離子化效率[29],因此本實(shí)驗(yàn)選擇使用乙腈和5 mmol/L乙酸銨作為檢測(cè)奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的流動(dòng)相。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

為了考察基質(zhì)效應(yīng),本試驗(yàn)建立了溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,其濃度均為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 μg/kg。通過(guò)比較兩條標(biāo)曲的斜率判定基質(zhì)效應(yīng)。具體計(jì)算公式如下:基質(zhì)效應(yīng)(ME,%)=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100。根據(jù)受到基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱,將基質(zhì)效應(yīng)分為三類(lèi):ME值低于-20%表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng);ME值介于-20%和20%之間表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng);ME值高于20%表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果如表2所示,所有目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng),為了降低基質(zhì)的干擾,保證定量的準(zhǔn)確性,本實(shí)驗(yàn)選擇內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定。

表2 奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect for zearalenone and its metabolites in milk

2.5 定量方式及線性關(guān)系

本文以β-玉米赤霉烯醇-d7為內(nèi)標(biāo),以陰性奶粉樣品提取液作為溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用內(nèi)標(biāo)法定量,6種目標(biāo)物的線性方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示。在陰性樣品中添加目標(biāo)化合物,按照給定的方法測(cè)定,在0.1～50 μg/L線性范圍以定性離子的信噪比S/N≥3對(duì)應(yīng)添加水平作為檢測(cè)限(LOD),定性離子的信噪比S/N≥10對(duì)應(yīng)的添加水平作為定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示該方法的檢出限為0.1 μg/kg,定量限為0.2μg/kg。

表3 玉米赤霉烯酮及其代謝物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear range,regression equation,correlation coefficient,LOD and LOQ of zearalenone and its metabolites

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

本實(shí)驗(yàn)為了考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,使用陰性奶粉為空白樣品,分別選擇LOQ的1倍、2倍和10倍濃度不同的玉米赤霉烯酮及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液作為添加量,按前述方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度7個(gè)平行。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn),均扣除本底值后計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。6種目標(biāo)物在奶粉中的添加回收率為85.2%～119.3%,RSD在0.3%～12.2%之間,符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 準(zhǔn)確性和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7)Table 4 Accuracy and precision of the method(n=7)

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS對(duì)奶粉中玉米赤霉烯酮及其代謝物的檢測(cè)方法。對(duì)提取方法、凈化條件等方面進(jìn)行優(yōu)化,最終選取使用10 mL超純水稀釋,1%乙酸乙腈提取,60 mg PSA、60 mg C18和100 mg無(wú)水硫酸鎂凈化,HPLC-MS/MS檢測(cè),內(nèi)標(biāo)法定量。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高,可推廣用于動(dòng)物性食品中玉米赤霉烯酮及其代謝物的檢測(cè)。