何文琪,王雅君,尤文靜,葛春暉,邵遠(yuǎn)志

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南海口 570228)

蓮霧[Syzygiumsamarangense(Blume)Merr. & L.M. Perry],又稱洋蒲桃,主要生長于熱帶,原產(chǎn)于馬來西亞、印度,17世紀(jì)傳入臺灣,海南、廣東、福建等沿海一帶均有種植。蓮霧果肉清甜多汁,具有清熱解暑、調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿平衡、減少腸道對脂肪及膽固醇的吸收等功效[1]。但由于其采收期短、呼吸強度高、果皮組織幼嫩極不耐貯藏[2],隨著果實的成熟衰老,果肉出現(xiàn)絮狀綿軟并有失水現(xiàn)象伴隨發(fā)生,極易受病菌感染,嚴(yán)重影響蓮霧果實的食用價值和商品價值[3]。

蓮霧采后病害以軟腐病、炭疽病、焦腐病最為常見[4],而軟腐病由于病斑擴展速度迅速,在病害中尤為突出。目前,關(guān)于蓮霧采后病害報道較少,僅李楊秀等[5]、羅志文[6]對蓮霧采后主要真菌病害病原菌進(jìn)行了分離鑒定。目前,蓮霧采后病害的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑。但由于其農(nóng)藥殘留對人體會造成傷害,且對環(huán)境會造成不可逆污染[7],研究人員目前研究了相對安全的防治方法,例如NO熏蒸[8]、植物精油抑菌[9],但防治效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)殺菌劑。生物防治由于其綠色安全、不易形成抗性等優(yōu)點,成為國內(nèi)外果蔬采后病害研究的熱點[10],已有部分拮抗菌應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。我國研制的有效成分為枯草芽孢桿菌B908的農(nóng)藥“百抗”已獲得農(nóng)藥部登記注冊[11];在澳大利亞、美國等九個國家推廣應(yīng)用的土壤放射桿菌K-84能抑制桃根癌病[12];哈茨木霉MAUL20是北美第一個成功的生防制劑,對香蕉炭疽病、桃和葡萄的灰霉病有明顯抑制效果[13-14]。但利用拮抗微生物來抑制蓮霧采后病原菌還未見報道,同時其拮抗機理的研究有助于更好地發(fā)現(xiàn)有效的拮抗菌和使用增效劑提高拮抗菌的效果。

本研究從蓮霧軟腐病病斑處分離鑒定出一株蓮霧軟腐病病原菌,針對該病原菌從瓊海蓮霧種植基地土壤中分離篩選拮抗效果較好的生防菌,并在蓮霧果實上驗證其活體防效和對拮抗機理的初步探究,以期對蓮霧采后軟腐病的生物防治研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試果實 在海南瓊海蓮霧種植基地選取具有典型軟腐病病癥的果實共30個,并于同地區(qū)采集相同品種、大小顏色均一的健康果實若干作為致病性檢驗和體內(nèi)實驗用果;拮抗菌 在海南瓊海的蓮霧種植基地,采取不同果樹根系10 cm深處土壤,用保鮮袋標(biāo)記分裝,帶回實驗室4 ℃冰箱保藏備用;酵母提取粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;細(xì)菌學(xué)蛋白胨 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;牛肉浸膏 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;技術(shù)瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;葡萄糖 廣州化學(xué)試劑廠;氯化鈉 廣州化學(xué)試劑廠。

BCM-1000生物凈化工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;FYL-YS-280L型恒溫箱 北京福意電器有限公司;BIC-300控溫控濕培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;AL-204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZEALWAYGR60DA高壓滅菌器 廈門致微儀器有限公司;NRY-211恒溫培養(yǎng)搖床 上海南榮實驗室設(shè)備有限公司;Nikon ECLIPSE Ci-s/Ci-L顯微鏡 南京衡橋儀器有限公司;TG16KR臺式高速冷凍離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司;UV-1100型 紫外可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離及鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法[15]。選取新發(fā)病狀態(tài)的蓮霧果實,用無菌小刀切取病健交界處組織(5 mm×5 mm),用75%酒精和1%次氯酸鈉溶液依次消毒30 s,隨后用無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸干水分后置于PDA培養(yǎng)基平板上,于28 ℃培養(yǎng)3～5 d,挑取邊緣菌絲于新的PDA劃線分離,重復(fù)直至得到純化的病原菌。將純化好的菌株保存于PDA斜面上,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 形態(tài)特征觀察 將純化后的病原菌在PDA上28 ℃培養(yǎng)3～5 d后,觀察菌落特征,在顯微鏡下觀察菌絲和孢子的形態(tài)特征。參照《真菌鑒定手冊》[16]進(jìn)行初步鑒定。

1.2.1.3 致病性檢驗 采用科赫法則驗證[17]。選取健康、大小成熟度一致的蓮霧果實,用75%酒精消毒后無菌水沖洗。取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d的病原菌菌餅(8 mm×8 mm),小心置于蓮霧果實表面,每果接種3個,以接種PDA培養(yǎng)基為對照,置于28 ℃,相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察發(fā)病情況。

1.2.1.4 基因序列的測定 病原菌DNA由Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試盒劑提取,采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′)進(jìn)行擴增。擴增程序:預(yù)變性94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min;循環(huán)數(shù)30。PCR產(chǎn)物交由上海生工股份有限公司測序。測序結(jié)果與核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank比對。

1.2.2 拮抗菌的分離及篩選

1.2.2.1 拮抗菌分離純化 采用稀釋平板法和平板劃線法[18]。將采集的樣品各取10 g加入到含有90 mL無菌水的錐形瓶中,置于28 ℃、100 r/min搖床振蕩2～3 h,取混勻后的樣品稀釋至10-3、10-4、10-5,分別涂布于YPD、NA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取不同形態(tài)的菌落單獨劃線,直至得到單一菌落,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 拮抗菌篩選 純化后的菌株與病原菌經(jīng)平板對峙實驗[19]進(jìn)行拮抗菌初篩,采用濾紙片法對初篩有拮抗效果的菌株重復(fù)進(jìn)行復(fù)篩,并采用十字交叉法測量抑菌圈直徑,每株菌3次重復(fù)。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 取純化后的拮抗菌于28 ℃下培養(yǎng)48 h后,參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]對菌落形態(tài)進(jìn)行觀察,并通過革蘭氏染色、碳源同化、氮源同化、接觸酶、淀粉水解等生理生化特征的測定進(jìn)行初步鑒定。拮抗菌D-1 DNA由Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取,采用通用引物7F(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540R(5′-AGGA GGTGATCCAGCCGCA-3′)擴增。擴增程序:預(yù)變性96 ℃ 1 min;96 ℃ 10 s,50 ℃ 5 s,60 ℃ 4 min;循環(huán)數(shù)25。PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司測序,測序結(jié)果與核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank比對。

1.2.4 拮抗菌對蓮霧軟腐病的防治效果

1.2.4.1 活體防效實驗 選取大小、成熟度一致的健康果實,用75%酒精和1%次氯酸鈉溶液依次浸泡3 min,隨后用清水沖洗,自然風(fēng)干。參照Zhou等[21]方法并做修改。用無菌打孔器于果實中線位置打孔(5 mm×3 mm),每組10個果實,分別在傷口處加入20 μL以下溶液:A:無菌水;B:病原菌孢子懸浮液;C:病原菌孢子懸浮液和D-1菌懸液。用無菌水配制濃度為1×105spores/mL病原菌孢子懸浮液濃度,1×108CFU/mL D-1菌懸液。置于25 ℃、濕度90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d,測量其病斑直徑,計算發(fā)病率。

發(fā)病率(%)=發(fā)病孔數(shù)/接種孔數(shù)×100

1.2.4.2 拮抗菌在果實傷口處的競爭作用 a. 拮抗菌生長動態(tài):果實按照1.2.4.1的方法清洗,風(fēng)干后,參照羅楊[22]的方法做了一定修改。用無菌打孔器在果實中線位置打孔(5 mm×3 mm)。每個傷口處接種20 μL D-1菌懸液(1×108CFU/mL),2 h后接10 μL 病原菌孢子懸浮液(1×105spores/mL),采用無菌水配制菌液并以無菌水作對照。單果包裝于25 ℃,濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以接種后1 h為起始每12 h取樣,采用涂抹平板計數(shù)法計算傷口處拮抗菌活菌數(shù)量。每處理5個果實,重復(fù)3次,結(jié)果以每傷口處細(xì)菌數(shù)量單位lg CFU/wound表示。b. 空間競爭:果實按照1.2.4.1的方法清洗,風(fēng)干后,用無菌打孔器在果實中線位置打孔(5 mm×3 mm),每組10個果實,分別在傷口處加入20 μL以下溶液:A:病原菌孢子懸浮液;B:同時接入病原菌孢子懸浮液和D-1菌懸液;C:先接入病原菌孢子懸浮液,12 h后接入D-1菌懸液;D:先接D-1菌懸液,12 h后接入病原菌孢子懸浮液。用無菌水配制濃度為1×105spores/mL病原菌孢子懸浮液濃度,1×108CFU/mL D-1菌懸液。在25 ℃,濕度90%培養(yǎng)9 d,測量其病斑直徑,計算抑制率。

抑制率(%)=未發(fā)病孔數(shù)/接種孔數(shù)×100

1.2.4.3 果實抗病相關(guān)酶活性的測定 果實按照1.2.4.1的方法清洗,風(fēng)干后,用無菌打孔器在果實中線位置等距離打2個孔(5 mm×3 mm),每組30個果,分別在傷口加入20 μL以下溶液:A.無菌水;B.D-1菌懸液(1×108CFU/mL),1 h后在每個傷口處加入20 μL孢子懸浮液(1×105spores/mL)。采用無菌水配制菌液并以無菌水作對照。待菌液吸收后,單果包裝貯藏于25 ℃,濕度90%培養(yǎng)箱中。取樣方法:常溫條件下,在貯藏第0、2、4、6、8、10 d,取果實傷口外直徑1 cm處的健康果實組織(不包含傷口部位)。每個處理3個重復(fù)。

a. 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定:參照Yao等[23]的方法做了一定修改。取樣品2 g用5 mL 0.1 mol/L pH8.8硼酸緩沖液(含1%聚乙烯吡咯烷酮K30)研磨成勻漿,再用硼酸緩沖液沖洗研缽定容至7 mL,4 ℃、8000 r/min離心20 min,上清液即為粗酶液。取一支試管中加入0.5 mL粗酶液,2 mL 0.1 mol/L pH8.8 硼酸緩沖液,最后加入1 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸啟動反應(yīng)。以不加酶液,加緩沖液為對照。在37 ℃水浴鍋中保溫1 h后加入0.1 mL 6 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。290 nm處測定吸光值,以吸光值變化0.01為一個酶活力單位。

b. 過氧化物酶(POD)活性測定:參照Qin等[24]的方法做了一定修改。取樣品2 g用5 mL 0.05 mol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液(含1%聚乙烯吡咯烷酮K30)研磨成勻漿,再用磷酸鹽緩沖液沖洗研缽定容至7 mL,4 ℃、8000 r/min離心20 min,上清液即為粗酶液。取一支試管中加入0.5 mL粗酶液,3 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚,最后加入200 μL 2%過氧化氫啟動反應(yīng)。以不加酶液,加0.05 mol/L pH7.0 磷酸鹽緩沖液為對照。在37 ℃水浴鍋中保溫30 min后,每分鐘在470 nm處測定吸光值,連續(xù)測定15 min。以每分鐘吸光值變化0.01為一個酶活力單位。

c. 多酚氧化酶(PPO)活性測定:參照邱思鑫等[25]的方法做了一定修改。酶液提取同方法中POD活性的測定。取一支試管加入100 μL粗酶液、1 mL鄰苯二酚、4 mL緩沖液。以不加酶液,加入緩沖液為對照。在37 ℃水浴鍋中保溫30 min后,每分鐘在410 nm處測定吸光度值,連續(xù)測定15 min。以每分鐘吸光值變化0.001為一個酶活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行計算,OriginPro 8.5進(jìn)行繪圖,SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計,并采用ANOVA進(jìn)行Duncan多重差異分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

2.1.1 病原菌形態(tài)特征觀察 由圖1可知,病原菌R1在PDA上近圓形(圖1A),菌落出現(xiàn)同心輪紋,正面菌絲為白色,菌落平展,擴展迅速,培養(yǎng)基背面則為淡橙黃色(圖1B)。而后輪紋上長出黑色小點,散生,為病原菌的分生孢子,排列疏散,但顆粒較大。顯微鏡下觀察孢子形態(tài),呈梭形,中間3個細(xì)胞著色,上2個細(xì)胞顏色較深,底端細(xì)胞呈無色。頂端有2～3根無色附屬絲,尾部著生1根基附屬絲(圖1C)。菌絲著色較深,且有隔膜(圖1D)。結(jié)合病原菌形態(tài)特征,根據(jù)《真菌鑒定手冊》,初步判定病原菌為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)。

圖1 病原菌菌落形態(tài)和顯微鏡下孢子和菌絲形態(tài)Fig.1 Photographs of colonies and spores of the pathogen注:圖A、B分別為菌落正反面特征圖;圖C為分生孢子(×40);圖D為菌絲(×40)。

2.1.2 致病性檢驗 通過實驗從病果病健交界處分離出3株致病真菌,采用科赫法則進(jìn)行反接實驗,發(fā)現(xiàn)在第3～4 d,接種R1的菌株蓮霧表皮出現(xiàn)水漬狀淡黃色圓斑,果實變軟,多個圓斑接合內(nèi)凹,圓斑中心出現(xiàn)白色菌絲,后期病斑處出現(xiàn)同心輪紋狀的黑色突起小點,與蓮霧軟腐病發(fā)病病癥相似。而空白組則在第5 d果實開始軟化,第7 d發(fā)病出現(xiàn)淡黃色病斑。采用上述1.2.1.1實驗步驟對病果進(jìn)行分離,分離出病原菌的菌落形態(tài)與R1一致,屬于同一菌株,所以得出R1是造成蓮霧軟腐病的病原菌。

2.1.3 分子生物學(xué)鑒定 病原菌R1擴增結(jié)果如圖2所示。經(jīng)測序得到擴增片段長度為529 bp的核苷酸序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過同源性對比,結(jié)果顯示病原菌與Pestalotiopsismicrospora(MH094237.1)的ITS序列同源性為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果,該病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢。

圖2 病原菌ITS區(qū)PCR擴增電泳圖Fig.2 PCR amplification of ITS sequence of the pathogen注:M為DNA Ladder Mix maker,A為R1的擴增產(chǎn)物。

2.2 拮抗菌的篩選

從瓊海蓮霧種植基地采取的根系土壤樣品中共分離出143株菌,采用平板對峙法,得到22株對病原菌具有拮抗效果的菌株。經(jīng)復(fù)篩后,共8株拮抗菌效果明顯,其抑菌圈直徑與抑菌率如表1所示。其中D-1的拮抗效果最佳,抑菌圈直徑達(dá)到(11.10±0.45) mm,抑菌率為55.25%(如圖3)。

表1 拮抗菌對病原菌的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of antagonistic bacteria on pathogenic bacteria

圖3 拮抗細(xì)菌D-1對病原菌的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of antagonistic bacteria D-1 on pathogenic bacteria

2.3 拮抗菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定 拮抗菌D-1菌落呈乳白色,邊緣光滑平整,中心凸起有光澤,經(jīng)革蘭氏染色為陽性菌,桿狀有芽孢。對拮抗菌D-1進(jìn)行了生理生化實驗,包括:接觸酶實驗、碳源同化、氮源同化、耐鹽性、淀粉水解、硝酸鹽還原、吲哚實驗、甲基紅實驗、V-P測定、丙二酸鹽利用和糖醇發(fā)酵實驗,結(jié)果見表2。由表2可知,拮抗菌D-1可利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖等多種糖類,不能利用但可還原硝酸鹽,耐鹽性高,具有過氧化氫酶。綜上可初步鑒定菌株D-1為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

表2 拮抗菌D-1的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characters of the antagonistic bacteria D-1

2.3.2 16S rDNA測序 拮抗菌D-1擴增結(jié)果如圖4所示。經(jīng)測序得到長度為1491 bp的核苷酸序列,通過與GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性對比,結(jié)果顯示拮抗菌D-1與Bacillussafensis(CP018100.1)的16S rDNA同源性為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征,將D-1鑒定為沙福芽孢桿菌。

圖4 拮抗菌D-1擴增電泳圖Fig.4 PCR amplification of the antagonistic bacteria D-1注:M為DNA Ladder Mix maker,B為D-1擴增產(chǎn)物。

2.4 拮抗菌對蓮霧軟腐病的防治效果

2.4.1 活體防效實驗 如圖5所示,通過在果實傷口處同孔接種,在常溫貯藏條件下,在貯藏第7 d時,蓮霧開始發(fā)病,隨著時間的延長,蓮霧軟腐病擴展迅速并至第9 d時,處理組B全部發(fā)病。處理組A雖然病斑無明顯擴展,但其病斑直徑與發(fā)病率始終高于處理組C。處理組B果實軟腐病的發(fā)病率達(dá)到100%,病斑直徑達(dá)18 mm,而處理組A、C的發(fā)病率分別為60%、50%,病斑直徑分別為15.1、14.2 mm,顯著低于處理組B(P<0.05)。表明當(dāng)D-1與R1同孔接種時,可以有效地降低果實軟腐病的發(fā)生,同時減緩果實病斑擴展(P<0.05)。

圖5 常溫條件下傷口處拮抗菌D-1對軟腐病的控制效果Fig.5 Effects of D-1 to control soft rot disease in wounds at 25 ℃注:A:無菌水;B:R1孢子懸浮液;C:R1孢子懸浮液+D-1菌懸液。

2.4.2 拮抗菌在果實傷口處的競爭作用 如圖6所示,在常溫條件下,活菌數(shù)量總體呈現(xiàn)先上升后下降的生長趨勢。前12 h拮抗菌D-1在果實傷口處迅速定殖,而后12～36 h生長速度漸緩并在36 h處達(dá)到最大值。病原菌和拮抗菌同孔接種時,D-1能在傷口處迅速生長定殖,數(shù)量明顯多于未接病原菌時的情況,表明同孔接種時R1并未抑制D-1的生長,反而起到了促進(jìn)作用。

圖6 常溫條件下D-1與R1同孔接種在蓮霧傷口處生長動態(tài)Fig.6 The growth dynamics of D-1 and R1 in the same wax apple wound at 25 ℃

如圖7所示,在常溫條件下,當(dāng)貯藏到第9 d時處理組A全部發(fā)病,抑制率為0,病斑直徑達(dá)到18 mm,而處理組B、C、D病斑直徑分別為13.2、14.2和13.1 mm,抑制率分別為60%、50%、70%,均高于處理組A。綜上可以看出,越早接種拮抗菌,則可提前占據(jù)有利空間,病斑直徑越小,對蓮霧軟腐病的抑制率越高。

圖7 接種時間對病斑直徑和抑制率的影響Fig.7 Effect of inoculation time on lesion diameter and inhibition rate注:A:R1孢子懸浮液;B:R1孢子懸浮液+D-1菌懸液;C:先接R1孢子懸浮液,12 h后接D-1菌懸液;D:先接D-1菌懸液,12 h后接R1孢子懸浮液。

2.4.3 果實抗病相關(guān)酶活性變化

2.4.3.1 PAL活性 如圖8所示,在常溫條件下,D-1處理組與對照組果實PAL活性總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在貯藏第0～4 d,D-1處理并未對果實PAL活性產(chǎn)生明顯影響,與對照組曲線幾乎重合,而在第4～6 d,兩組處理組酶活性迅速上升,并在第6 d達(dá)到最大值,且D-1處理組酶活性為對照組的1.15倍,顯著高于對照組(P<0.05)。之后,兩組處理酶活性又大幅下降,但D-1處理組PAL活性依舊高于對照。

圖8 拮抗菌D-1處理后蓮霧果實PAL活性的變化Fig.8 Dynamic changes of PAL activity in the treatments in wax apple

2.4.3.2 POD活性 如圖9所示,在常溫條件下,D-1處理組與對照組果實POD活性總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢。在貯藏第0～4 d,兩組處理酶活性迅速上升,并于第4 d達(dá)到最大值,且D-1處理組酶活性為對照組的1.43倍,顯著高于對照組(P<0.05)。而在第4～6 d,兩組處理酶活性迅速下降,且D-1處理組下降幅度更大。盡管貯藏后期下降幅度減緩,D-1處理組有略微上升的趨勢,最終兩組處理POD活性依舊低于原始水平。

圖9 拮抗菌D-1處理后蓮霧果實POD活性的變化Fig.9 Dynamic changes of POD activity in the treatments in wax apple

2.4.3.3 PPO活性 如圖10所示,在常溫條件下,D-1處理組與對照組果實PPO活性總體呈現(xiàn)先升后降再升的波浪式變化。D-1處理組在貯藏前4 d酶活性迅速上升,并在第4 d達(dá)到峰值,酶活性為對照組的2.49倍,顯著高于對照組(P<0.05),在第4～6 d,PPO活性下降至與對照組同一水平。而對照組在貯藏第0～6 d酶活性一直緩慢上升,直到第6 d達(dá)到一個高峰,隨后下降,在第10 d又達(dá)到一個峰值。在整個貯藏期間,D-1處理組PPO活性始終高于對照組。

圖10 拮抗菌D-1處理后蓮霧果實PPO活性的變化Fig.10 Dynamic changes of PPO activity in the treatments in wax apple

3 討論與結(jié)論

蓮霧軟腐病是蓮霧采后主要的病害之一,嚴(yán)重影響其貯藏保鮮。本研究利用組織分離法從發(fā)病的果實病斑處分離得到了病原菌,通過科赫法則驗證、形態(tài)學(xué)和分子測序,鑒定出病原菌R1為小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)。從瓊海蓮霧種植基地采取的根系土壤樣品中分離得到一株對蓮霧軟腐病病原菌具有明顯拮抗效果的菌株D-1,抑菌直徑11.10 mm,抑菌率達(dá)55.25%,并通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征、分子測序鑒定為沙福芽孢桿菌。之前已有利用沙福芽孢桿菌作為生防菌株的相關(guān)報道,馮玉衡[26]篩選出兩株沙福芽孢桿菌用于抑制馬鈴薯黑痣病和枯萎病,杜秉海等[27]等發(fā)明一項關(guān)于沙福芽孢桿菌抗番茄灰霉病菌的專利,徐同偉等[28]篩選出一株沙福芽孢桿菌用于抑制煙草黑脛病。因此,拮抗菌D-1可以作為抑制蓮霧軟腐病的潛在生防菌。但目前商業(yè)化的拮抗菌很少,主要還是由于拮抗機理尚不清楚,對其生產(chǎn)應(yīng)用造成了阻力。

研究表明,數(shù)量充足的拮抗菌在果實傷口處可以較病原菌更有效地利用有限的空間資源[29],一些拮抗細(xì)菌可以成功通過空間的競爭達(dá)到抑菌效果,但不會殺死病原菌[30]。張婕[31]發(fā)現(xiàn)拮抗菌P.membranaefaciens和K.apiculata可在李果實傷口處迅速定殖、生長,接種病原菌后,病原菌的存在未影響拮抗酵母的生長,反而對其有促進(jìn)作用。Francesco等[32]發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉菌和桃褐腐病菌同時接種時,出芽短梗霉菌能優(yōu)先定殖,抑制病原菌生長。因此,拮抗菌若能在受傷果實表面定殖,則需要自身具有相應(yīng)的附著能力,而通過近年對拮抗菌的研究,附著于果實表面的拮抗菌可有效降低果實發(fā)病率。其中很大程度與拮抗菌誘導(dǎo)果蔬組織增加其抗病性有關(guān)。Mahunu等[33]發(fā)現(xiàn),在蘋果中接入Pichiacaribbica,其抗病相關(guān)酶POD、PPO含量顯著上升。周雅涵[34]發(fā)現(xiàn)膜醭畢赤酵母接種到柑橘傷口處后,提高了組織中PAL活性,增加柑橘抗性。Lu等[35]報道拮抗酵母菌Rhodosporidiumpaludigenum誘導(dǎo)果蔬抗性,提高PAL、POD和PPO活性。本研究實驗表明,D-1能夠占據(jù)有利空間,達(dá)到抑菌的效果,并且誘導(dǎo)了果實PAL、POD、PPO活性上升,提高果實自身的控病能力。

綜上所述,沙福芽孢桿菌能夠抑制蓮霧果實軟腐病病斑擴展,降低發(fā)病率,并且能夠在果實傷口處快速定殖形成空間競爭,同時提高果實病程相關(guān)酶PAL、POD和PPO的活性(P<0.05),提高果實的抗病能力,為蓮霧采后軟腐病的生物防治研究提供理論依據(jù)。