紀(jì)麗獻(xiàn)，段新旺*，牛海濤

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南昌 330006； 2. 國家衛(wèi)生健康委員會人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局，北京 100021)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)簡稱狼瘡，是好發(fā)于育齡女性的自身免疫性結(jié)締組織病，主要特點(diǎn)是自身抗體(抗dsDNA抗體、抗ANA抗體等)水平升高及免疫復(fù)合物的形成[1]。SLE發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)SLE與環(huán)境、性別、年齡、遺傳等因素有一定相關(guān)性[2]。此外，B淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞免疫耐受的缺失與SLE的發(fā)病密切相關(guān)[3-4]。SLE臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，常合并腎病變、神經(jīng)系統(tǒng)病變、血液系統(tǒng)病變及消化系統(tǒng)病變等。目前臨床治療狼瘡的藥物主要包括糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及抗瘧藥等[5]。

羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)是一種經(jīng)典的抗瘧藥，由于其具有免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等特性，也用于臨床治療SLE和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫性疾病[6]。HCQ治療SLE的主要機(jī)制包括：干擾抗原的加工和表達(dá)，減少紫外線對皮膚的反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激，阻斷Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)信號通路和降低金屬樣蛋白酶活性等[7-8]。HCQ對關(guān)節(jié)、皮膚損傷療效好，可降低狼瘡患者動脈粥樣硬化發(fā)生等風(fēng)險，減少疾病過程對機(jī)體的損害[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在SLE的治療中，HCQ可以抑制外周血Th17細(xì)胞的分化和IL-17的產(chǎn)生[10]。然而，在狼瘡的治療中，HCQ對B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響研究甚少，因此，本文從脾B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的角度出發(fā)，初步探究HCQ對狼瘡小鼠外周免疫器官淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

18只雌性TC小鼠，30周齡，體重(26 ± 3)g。TC小鼠為純合狼瘡小鼠(B6.NZMSle1/2/3)，能充分模擬人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病表征[11]，由美國佛羅里達(dá)大學(xué)Morel Laurence教授實(shí)驗(yàn)室贈送。所有動物飼養(yǎng)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所SPF動物房【SYXK(京)2015 - 0035】，飼養(yǎng)溫度22～ 24℃，濕度40% ～ 70%，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)照明。所有實(shí)驗(yàn)動物操作均符合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求(倫理審批號：IACUC NHT17002)。

1.1.2 試劑與材料

羥氯喹(批號：0000048213，Sigma公司)；包被抗原dsDNA、酶底物顯色劑phosphatase substrate和O.C.T冰凍組織包埋膠均購于Sigma公司；標(biāo)記抗體Gout Anti-Mouse IgG購于Southern Biotech公司；蘇木素、伊紅染色液購于北京盈利精細(xì)化有限公司；乙醇、二甲苯溶液購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Transcription Factor Buffer Set購于BD PharmingenTM公司；CD16/32購于Biolegend公司；流式標(biāo)記抗體均購于BD HorizonTM公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

18只雌性TC小鼠隨機(jī)分成兩組，每組9只，由3個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)組成。①實(shí)驗(yàn)組：給予10 mg/(kg·d)HCQ灌胃處理；②對照組：給予10 mg/(kg·d)生理鹽水灌胃處理。

1.2.2 血清抗dsDNA抗體滴度檢測

小鼠臉頰靜脈采血50 μL，靜置，離心，取上清。ELISA法檢測血清抗dsDNA抗體滴度。

1.2.3 腎HE染色

小鼠麻醉處死，取腎組織，4%福爾馬林固定，石蠟包埋，切取6 μm厚組織切片進(jìn)行HE染色，光鏡下成像，采用雙盲法由2名病理技術(shù)人員分別對腎組織學(xué)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。腎組織病理評分根據(jù)腎小球增大、腎小球萎縮、免疫復(fù)合物沉積和炎性浸潤程度計算積分：0分，無累及；1分，1% ～ 25%；2分，26% ～ 50%；3分，51% ～ 75%；4分，76% ～ 100%。每只小鼠的腎組織取其皮質(zhì)下極部分的腎小球，每個腎取10個腎小球，累計積分，計算平均值。

1.2.4 制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液

小鼠麻醉處死，沿腹中線剖開取出脾，以載玻片研磨，懸于1%胎牛血清(1% FBS)中；以70 μm細(xì)胞過濾器過濾于15 mL離心管，離心，棄上清；加入5 mL預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，冰上靜置5 min；加入5 mL PBS重懸細(xì)胞，離心，棄上清；最后加入1 mL 5% FBS重懸細(xì)胞，獲取脾淋巴細(xì)胞懸液，計數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞染色及流式細(xì)胞分析

脾細(xì)胞懸液以50 μL CD16/32抗體封閉30 min，加入抗體混合液避光孵育30 min，400 r/min離心5 min，棄上清；加入1 mL預(yù)冷多聚甲醛固定20 min，以200 μL PBS重懸細(xì)胞，24 h內(nèi)于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(BD Symphony A5)，以Flow Jo ver.10(USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？贵w表面標(biāo)記為：CD19-BUV737、CD38-PE、CD95-BV510、PNA-FITC、CD3e-APC-Cy7、CD4-BUV395、CD8a-PerCP-Cy5.5、CD25-BB515；胞內(nèi)標(biāo)記為：Foxp3-BV421、IL-17 A-BV510。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組樣本間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩組小鼠抗dsDNA抗體滴度的變化采用Tukey’s檢驗(yàn)分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A：對照組TC小鼠腎HE染色(× 200，× 400)；B.：實(shí)驗(yàn)組TC小鼠腎HE染色(× 200，× 400)； C：腎組織病理學(xué)評分(P< 0.05)。圖2 兩組TC小鼠腎組織病理學(xué)改變Note. A, Kidney HE staining of TC mice in control group (× 200, × 400). B, Kidney HE staining of TC mice in experimental group (× 200, × 400). C, Renal histopathology score(P< 0.05).Figure 2 Histopathological changes of kidney in two groups of TC ± s，n=9)

2 結(jié)果

2.1 羥氯喹不影響TC小鼠抗dsDNA抗體滴度的變化

分別檢測兩組TC小鼠處理前、處理2周、處理5周時的血清抗dsDNA抗體滴度，結(jié)果均無明顯差異，HCQ對抗dsDNA抗體的變化無明顯作用(P> 0.05)(圖1)。

注：兩組小鼠在處理前、處理2周和處理5周時抗dsDNA抗體滴度OD值的變化(P> 0.05)。圖1 兩組TC小鼠抗dsDNA抗體滴度變化Note. OD value changes in anti-dsDNA antibody titers at pre-gavage, 2 weeks and 5 weeks after treatment in both groups of mice(P> 0.05).Figure 1 Changes of anti-dsDNA antibody titer in two

2.2 羥氯喹可有效緩解TC小鼠腎組織病理損傷

實(shí)驗(yàn)組TC小鼠與對照組TC小鼠腎HE染色對比，對照組腎小球增大、腎小球囊腔擴(kuò)張、腎小球內(nèi)蛋白樣物質(zhì)沉積增多，腎間質(zhì)細(xì)胞明顯增多，上皮細(xì)胞水腫，細(xì)胞形態(tài)紊亂，核碎裂，腎小管水腫，腎血管明顯狹窄(圖2A)。這些改變在HCQ處理的實(shí)驗(yàn)組明顯緩解(圖2B)，差異有顯著性(P< 0.05)(圖2C)。

2.3 HCQ 降低TC小鼠B淋巴細(xì)胞的高反應(yīng)性

流式細(xì)胞技術(shù)檢測小鼠脾B淋巴細(xì)胞(CD19+)、生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞(Germinal center B cells，CD19+CD38-CD95+PNA+)。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組小鼠B淋巴細(xì)胞比例顯著低于對照組小鼠(18.5% vs 65.5%，P< 0.05)(圖3A)；實(shí)驗(yàn)組小鼠生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞比例顯著低于對照組小鼠(19.9% vs 76.3%，P< 0.05)(圖3B)。

注：A：兩組小鼠脾B淋巴細(xì)胞比例(P< 0.05)；B.： 兩組小鼠脾生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞比例(P< 0.05)。生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞(GCs)圈自CD19+CD38-門。圖3 兩組TC小鼠脾B淋巴細(xì)胞比例Note. A, Proportion of spleen B lymphocytes in two groups of mice (P< 0.05). B, Proportion of B lymphocytes in the spleen germinal center of the two groups (P< 0.05). Germinal center B cells (GCs) gated from CD19+CD38-.Figure 3 Proportion of spleen B lymphocytes in two groups of TC ± s，n=9)

注：A：兩組小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞比例差異無顯著性(P> 0.05)。B、C兩組小鼠Th17淋巴細(xì)胞比例差異無顯著性(P> 0.05)。D、E：實(shí)驗(yàn)組小鼠Treg淋巴細(xì)胞顯著高于對照組(P< 0.05)。 Treg細(xì)胞圈自CD4+CD8-門。圖4 兩組TC小鼠脾T淋巴細(xì)胞比例Note. A, There was no significant difference in the proportion of CD4+ T lymphocytes and CD8+ T lymphocytes between the two groups of mice (P> 0.05). B and C, There was no significant difference in the proportion of Th17 lymphocytes between the two groups of mice (P> 0.05). D and E, Treg lymphocytes in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05). The Treg cell gated from CD4+CD8-.Figure 4 Proportion of spleen T lymphocytes in two groups of TC ± s，n=9)

2.4 HCQ升高TC小鼠調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例

流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞(CD3e+CD4+CD8a-)、CD8+T淋巴細(xì)胞(CD3e+CD4-CD8a+)、Th17細(xì)胞(CD3e+CD4+CD8a-IL17a+)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg cells，CD3e+CD4+CD8a-CD25+Foxp3+)。結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組小鼠與對照組小鼠相比，CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞比例差異無顯著性(P> 0.05)(圖4A)；兩組小鼠Th17細(xì)胞比例差異也無顯著性(P> 0.05)(圖4B-C)。但是，對比兩組小鼠Treg細(xì)胞比例，如圖4D-E所示實(shí)驗(yàn)組小鼠Treg細(xì)胞比例顯著高于對照組小鼠(1.35% vs 0.13%，P< 0.05)。

3 討論

3.1 HCQ處理不改變狼瘡小鼠抗dsDNA抗體滴度但可緩解腎損傷

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生理鹽水處理的TC小鼠，抗dsDNA抗體水平持續(xù)升高，HCQ處理的TC小鼠，前兩周抗dsDNA抗體水平持續(xù)升高，第2周至第5周有下降趨勢。但兩組小鼠在處理前、處理第2周及處理第5周時，抗dsDNA抗體水平變化并無顯著性差異。有研究報道，NZBWF1狼瘡小鼠經(jīng)灌胃給予HCQ 5周后，抗dsDNA抗體水平無明顯改變[12]。而在另外一篇報道中，NZBWF1狼瘡小鼠經(jīng)HCQ處理12周后，血清抗dsDNA抗體水平明顯降低[13]。因此，推測HCQ對抗dsDNA抗體水平的影響可能與給藥時間的長短有關(guān)。同時，與對照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞的比例變化也無明顯差異。由于漿細(xì)胞為直接產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，因此推測HCQ對抗dsDNA抗體水平無明顯影響，是否與HCQ對漿細(xì)胞比例無影響之間存在相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。以往研究發(fā)現(xiàn)HCQ對NZBWF1狼瘡小鼠的腎損傷有預(yù)防作用[14]，本實(shí)驗(yàn)觀察到實(shí)驗(yàn)組TC小鼠腎小球增大程度和炎性細(xì)胞浸潤程度均顯著低于對照組TC小鼠，給予HCQ治療后腎病理評分明顯降低，進(jìn)一步說明HCQ可有效緩解狼瘡小鼠腎疾病進(jìn)展。

3.2 HCQ通過降低B細(xì)胞免疫應(yīng)答而改善狼瘡疾病癥狀

SLE的一個眾所周知的特征是B細(xì)胞高反應(yīng)性，B細(xì)胞過度激活產(chǎn)生致病性自身抗體，向T細(xì)胞呈遞抗原，產(chǎn)生細(xì)胞因子向炎癥部位遷移[15]。在炎癥環(huán)境中，樹突狀細(xì)胞(dendritic Cells，DCs)捕獲抗原并發(fā)育成熟，隨后遷移到淋巴系統(tǒng)，將抗原呈遞給靜止的T細(xì)胞?；罨腡細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用，有利于漿細(xì)胞和抗體生成，產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答，狼瘡小鼠生發(fā)中心B細(xì)胞反應(yīng)性增加[16- 17]。HCQ可以在不同水平上干擾免疫反應(yīng)，其可以通過抑制TLR7和TLR9的信號來干擾先天免疫的激活[18]。該藥物在抗原呈遞細(xì)胞(DCs、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞)的溶酶體中的積累可抑制主要組織相容性復(fù)合物肽(MHC)向T細(xì)胞的呈遞，對自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[19]。因此，HCQ在SLE的治療中，對外周免疫器官淋巴細(xì)胞亞群的比例的影響具有進(jìn)一步探究的價值。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組小鼠脾淋巴細(xì)胞的比例，探究HCQ對TC小鼠外周淋巴器官免疫功能狀態(tài)的影響作用，結(jié)果表明， 實(shí)驗(yàn)組小鼠脾炎癥反應(yīng)相關(guān)B淋巴細(xì)胞與生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞比例均顯著低于對照組小鼠，提示HCQ可以抑制B淋巴細(xì)胞的免疫激活，逆轉(zhuǎn)外周淋巴器官的免疫應(yīng)答，從而改善疾病狀態(tài)。

3.3 HCQ可升高狼瘡小鼠調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例而維持免疫穩(wěn)態(tài)

T淋巴細(xì)胞包括CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞兩個亞群，CD4+主要為輔助性T細(xì)胞，CD8+主要為抑制性T細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞對狼瘡小鼠抗dsDNA抗體的產(chǎn)生有促進(jìn)作用[20]，De Groo等[21]發(fā)現(xiàn)TC小鼠脾中CD8+T淋巴細(xì)胞百分比降低。本實(shí)驗(yàn)中，兩組TC小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞比例變化均無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示在SLE的治療中，HCQ對CD4+T淋巴細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答無明顯影響。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞的兩個亞群。Treg細(xì)胞通過維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受來抑制免疫炎癥的發(fā)生[22]。在SLE患者發(fā)病期間，循環(huán)血中Treg細(xì)胞數(shù)量減少并且細(xì)胞的免疫抑制功能受損，恢復(fù)Treg細(xì)胞數(shù)量和功能后可改善狼瘡患者的癥狀，控制疾病的進(jìn)展[23-24]。相反地，Th17分泌的白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)是組織炎癥的誘導(dǎo)因子，促進(jìn)組織炎癥應(yīng)答，誘發(fā)自身免疫性疾病[25]。已證實(shí)SLE患者外周血中Th17和IL-17產(chǎn)生的數(shù)量均增加[23]，此外，在狼瘡小鼠模型(MRL/lpr)中也發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞數(shù)量的增加[26]。HCQ治療后的實(shí)驗(yàn)組TC小鼠Treg細(xì)胞比例明顯升高，而Th17細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示從T淋巴細(xì)胞角度分析，HCQ主要通過升高Treg細(xì)胞比例而降低炎癥反應(yīng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過對脾淋巴細(xì)胞流式分析，發(fā)現(xiàn)HCQ可降低炎癥性B淋巴細(xì)胞比例及升高調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例，從而緩解狼瘡的疾病進(jìn)展。證實(shí)HCQ對外周免疫器官的免疫應(yīng)答有調(diào)節(jié)作用，為HCQ在SLE的治療機(jī)制提供理論依據(jù)。