齊國將，鐘德琳，藍海梅，郭敏，郭亞楠，彭鵬

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院放射科，南寧 530021)

鐵離子是機體必不可少的微量元素之一，在機體參與氧氣運輸、血紅蛋白合成、DNA合成、線粒體能量代謝以及呼吸鏈復合體的組成等中起著關(guān)鍵的作用[1]。正常機體內(nèi)鐵代謝水平處于穩(wěn)定狀態(tài)，當體內(nèi)出現(xiàn)鐵的異常蓄積時，機體多個系統(tǒng)出現(xiàn)對應(yīng)的代謝障礙，影響人體健康。鐵過載是由于機體內(nèi)鐵供需關(guān)系失衡，鐵在某些組織臟器蓄積的病理過程。持續(xù)性輸血、長期攝入鐵劑過多、鐵代謝相關(guān)基因突變等原因是導致鐵過載的原因[2-3]。研究表明，鐵過載除了發(fā)生在血液系統(tǒng)疾病，如地中海貧血、骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血等因疾病本身原因?qū)е碌蔫F過載[4]，還和神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多個系統(tǒng)的疾病，如共濟失調(diào)、2型糖尿病、阿爾茲海默病、病毒性肝炎、心力衰竭等緊密相關(guān)[5-9]。鐵過載導致的心肌功能的損害越來越得到研究學者的關(guān)注[10-11]，但是由于臨床病人機體差異性大，活檢取材不便，重復性差，無法有效的得到鐵過載與心肌功能損害的關(guān)系。目前心肌鐵過載動物模型制作方法關(guān)于實驗動物的選擇并沒有一個統(tǒng)一的標準，比如：小鼠、大鼠、白兔等。在一些需要手術(shù)干預(yù)或者影像成像方面的研究，體型大的動物較小的易于操作。黃璐等的研究有提到家兔心肌鐵過載模型的制備，但是側(cè)重點在于心功能磁共振的評價，對于心肌鐵過載規(guī)律并沒有進行詳細分析[12]。本研究就心肌鐵超負荷家兔的制作方法及心肌鐵沉積規(guī)律進行探討，為鐵過載動物模型制作及心肌鐵沉積規(guī)律的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

普通級新西蘭白兔40只，3月齡，均為雄性，體重2.0 ～ 3.0 kg，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供【SCXK(桂)2014-0002】，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心【SYXK(桂) 2014-0003】，室內(nèi)溫度21 ～ 24℃，濕度50% ～ 70%，光源：明12 h/暗12 h 交替。隨機選取32只為實驗組，8只為正常對照組。普通兔營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，飲用自來水。所有新西蘭白兔操作均符合廣西醫(yī)科大學實驗動物福利與倫理委員會(倫理批準號:201807001)

1.1.2 儀器與試劑

右旋糖酐鐵(鐵濃度:150 mg/mL)購自廣西化工研究院獸藥廠；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9140 A型，上海柏欣儀器設(shè)備廠，中國)；火焰原子吸收分光光度計(ZA3000，日立公司，日本)。

1.2 方法

實驗組32只白兔每周一稱重后頸背部皮下注射右旋糖酐鐵，注射劑量為200 mg/kg。注射鐵劑7天(周日)隨機選取2只處死；每間隔1周隨機處死對照組1只。處死方法為經(jīng)兔耳緣靜脈注射過量的3%戊巴比妥鈉溶液致兔安樂死。處死前經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血2 mL，送廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科進行血清鐵(serum iron，SI)測定。兔處死后解剖取出心臟、肝。剔除心臟大血管及心包后，選取心室中部區(qū)域，用手術(shù)刀垂直心臟長軸橫斷切下約5 mm厚組織(保留完整的雙心室及室間隔結(jié)構(gòu))送檢病理。余心臟組織用生理鹽水反復沖洗，洗凈血液后置入電熱恒溫鼓風干燥箱(溫度65℃)烘干至重量不再變化(約需48 h)。烘干心臟組織送廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心經(jīng)粉碎、硝酸硝化處理后，用火焰原子吸收分光光度計測定心臟鐵濃度(cardiac iron concentration，CIC)。肝剔除大的血管、膽管等后，隨機選取小拇指大小組織送檢病理，余處理方式與心臟相同。送檢心、肝組織經(jīng)10%甲醛溶液固定24 h后，蠟埋、切片，行HE染色及普魯士藍染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 病理

2.1.1 大體病理

隨著右旋糖酐鐵劑量逐漸增加，肉眼觀實驗組白兔心臟大小、形態(tài)、硬度及表面顏色與正常對照組相比相差不明顯。實驗組白兔肝、脾與對照組相比，大小、形態(tài)及硬度無明顯變化，臟器顏色隨注射鐵劑時間的增加而逐漸變暗黑(圖1)。

注：A：正常白兔；B：注射鐵劑后第16周的白兔。圖1 白兔體內(nèi)臟器的大體病理(從左至右依次為脾、肝、心臟)Note. A, Normal rabbit. B, Rabbit of the 16th week after injection of iron.Figure 1 Gross pathology of internal organs in rabbits (spleen, liver, heart from left to right)

2.1.2 鏡下病理

實驗組白兔心肌、肝鐵經(jīng)普魯士藍染色，通過顯微鏡下觀察肝及心肌室間隔位置鐵含量。第1周心肌內(nèi)未見鐵顆粒沉積(0級)；肝內(nèi)見彌漫分布鐵顆粒，不僅肝竇內(nèi)有鐵沉積，部分肝細胞內(nèi)也可見鐵顆粒(0級)。第2周開始，心肌內(nèi)可見散在細小的鐵顆粒，分布范圍< 50%(I級；圖2A)，第5 ～ 16周，心肌內(nèi)見較彌漫鐵顆粒沉積，分布范圍50% ～ 75%(II級；圖2B)。實驗過程中未見Ⅲ級鐵沉積。隨著注射鐵劑劑量的增加，心肌內(nèi)鐵沉積顆粒逐漸增多，鐵顆粒多沉積于細胞間質(zhì)，少量進入細胞內(nèi)。第2周開始幾乎所有肝竇及肝細胞內(nèi)見大量鐵顆粒，受累陽性細胞約100%(III級；圖2C)。最終得到心肌鐵沉積家兔病理分級0級2只，I級12只，II級17只(1只結(jié)果缺失)。實驗全程正常對照組白兔心肌、肝內(nèi)未見鐵顆粒沉積(圖2D)。

注：A：實驗組白兔(2周)，心肌內(nèi)可見散在細小的鐵染色顆粒。 B：實驗組白兔(16周)，心肌內(nèi)可見較多塊狀的鐵染色顆粒。 C：實驗組白兔(8周)，幾乎所有肝竇及肝細胞內(nèi)均可見大量顆粒狀、塊狀鐵染色顆粒沉積。D：對照組正常白兔心肌內(nèi)未見鐵染色顆粒。圖2 各組兔肝、心肌組織普魯士藍染色(× 400)Note: A， Rabbits in the experimental group (2 weeks)， scattered fine iron staining particles can be seen in the myocardium. B, Rabbits in the experimental group (16 weeks), more massive iron staining particles can be seen in the myocardium. C, Rabbits in the experimental group (8 weeks), a large number of granular and massive iron staining granules were deposited in almost all hepatic sinusoids and hepatocytes. D, No iron staining particles were found in the myocardium of normal rabbits in the control group.Figure 2 Prussian blue staining of rabbit liver and myocardial tissues in each group (×400)

2.2 實驗組白兔的CIC、LIC、SI和注射鐵總量之間的關(guān)系

如圖3所示，CIC與LIC之間高度相關(guān)(r=0.712，P< 0.001；圖3A)；注射鐵總量與CIC之間中度相關(guān)(r=0.698，P< 0.001；圖3B)，與LIC之間高度相關(guān)(r=0.866，P< 0.001；圖3C)；SI與注射鐵總量之間無相關(guān)(r=0.205，P=0.277；圖3D)，與CIC之間中度相關(guān)(r=0.415，P=0.022；圖3E)，與LIC之間無相關(guān)(r=0.170，P=0.370；圖3F)。

2.3 實驗組白兔與對照組白兔CIC、LIC的關(guān)系

32只實驗組白兔隨著注射鐵劑時間的增加，心、肝鐵濃度總體呈上升趨勢。8只正常對照組白兔心、肝鐵濃度不隨實驗周數(shù)的增加而上升。與對照組白兔相比，實驗組白兔心鐵和肝鐵濃度明顯增加，差別均具有統(tǒng)計學意義(表1)。

圖3 32只實驗組白兔的CIC、LIC、SI和注射鐵總量之間的散點圖Figure 3 Scatter plots between CIC, LIC, SI and total iron injection of 32 rabbits in the experimental group

表1 實驗組與對照組心肌、肝鐵濃度的比較
Table 1 Comparison of cardiac iron concentration (CIC) and liver iron concentration (LIC) between experimental group and control group

心肌鐵濃度(mg/g干重)Cardiac iron concentration (mg/g dry weight)肝鐵濃度(mg/g干重)Liver iron concentration (mg/g dry weight)實驗組(n=32)Experimental group(n=32)對照組(n=8)Control group(n=8)實驗組(n=32)Experimental group(n=32)對照組(n=8)Control group(n=8)中位數(shù)Median1.2350.21547.2500.675最大值Maximum2.3400.30079.8000.840最小值Minimum0.2000.2008.2100.410z-4.059-4.328P< 0.001< 0.001

3 討論

3.1 建立心肌鐵超負荷動物模型的意義

鐵超負荷是鐵元素在體內(nèi)的異常蓄積。大量的鐵在重要臟器組織內(nèi)沉積，尤其是肝[14]、脾、胰腺和心臟等，導致各個臟器功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷[15]。鐵過載所致心肌病仍然是鐵超負荷患者發(fā)病率和死亡率的最主要原因[11,16]。心內(nèi)膜活檢的風險大、心肌鐵沉積位置分布不均、重復性差，心肌活檢常常不能取到鐵沉積所在的組織，導致活檢結(jié)果出現(xiàn)陰性的可能。目前，心臟鐵超負荷診斷和治療的研究進展緩慢，關(guān)于這方面的報道較少。因此建立心肌鐵超負荷的動物模型對深入研究鐵過載對心臟的影響和機制有著重大意義。

3.2 制作心鐵超負荷動物模型

目前，國內(nèi)外常用的鐵沉積動物模型辦法包括三種：第一種是注射鐵劑法[17]，第二種是羰基鐵飼料飼養(yǎng)法[18]，第三種是基因剔除敲除法[19]。第二種操作簡單、方便、死亡率低，長期讓動物進食含有羰基鐵飼料致使鐵主要沉積在肝，缺點是造模時間長。第三種基因敲除法通過基因敲除特定的鐵代謝基因，使動物鐵代謝紊亂，優(yōu)點是為鐵代謝和新藥治療提供新的一個新的動物模型，缺點是基因敲除動物價格高而且存活率低。第一種辦法造模成功率高，操作較為簡單，通過肌肉注射鐵劑或者皮下注射鐵劑，可以在短期內(nèi)、大規(guī)模制作大量的鐵超負荷動物模型。采用注射鐵劑的方法，需要根據(jù)實驗動物對鐵中毒的耐受力，所需造成鐵沉積的目標臟器和注射藥物的劑量等不同而采用不同的注射方式。肝、脾和骨髓等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)是鐵沉積第一站。在鐵超負荷狀態(tài)下，循環(huán)血液中的轉(zhuǎn)鐵蛋白逐漸飽和，非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrin-bound iron，NTBI)出現(xiàn)。NTBI是一種不穩(wěn)定、有高度細胞毒性的物質(zhì)，其進入心肌細胞，導致心肌的可變鐵水平增高，最后以鐵蛋白及含鐵血黃素形式沉積存在。本研究鐵沉積的器官是心臟，根據(jù)體內(nèi)鐵沉積規(guī)律，要造成心肌鐵沉積，必須在短期內(nèi)使血液中轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和，因此必須加大注射鐵劑量。文獻報道通過肌肉注射鐵劑(劑量為15 mg/kg)利用家兔可以建立肝鐵超負荷模型[20-21]，但是要造成心肌鐵沉積注射鐵劑量太大，肌肉反復注射家兔難以耐受，容易死亡。采用靜脈及腹腔注射，鐵吸收快，但易致急性毒性反應(yīng)，再者易感染，家兔死亡率增高。本研究采用家兔頸背部皮下注射，因為右旋糖酐鐵分子較大，須由淋巴管吸收再入血液，所以皮下注射后鐵濃度提高相對較慢，短期鐵毒性小，家兔易耐受。

人類缺乏鐵排泄機制，心肌中沉積的鐵主要以鐵蛋白和含鐵血黃素的形式存在。然而，大多數(shù)其它哺乳動物卻能以不同的速度排出體內(nèi)多余的鐵[22]。因此，難以選擇適合的動物建立完全模擬人體組織鐵沉積過程的模型。目前，國內(nèi)外關(guān)于實驗動物的選擇上尚未達成共識，如：小鼠、大鼠[23]、白兔等。對于建立心肌鐵沉積動物模型注射鐵劑量的選擇，文獻報道的有200 mg/kg(低劑量)、400 mg/kg(中等劑量)和800 mg/kg(高劑量)三種[17,24-25]。為了探討鐵劑注射劑量對成模的影響，預(yù)實驗我們首先按照400 mg/kg及800 mg/kg的劑量注射右旋糖酐鐵，每周皮下注射1次。注射4 ～ 6次后，家兔全部死亡，解剖病理示肝、脾內(nèi)重度鐵沉積，但是心肌僅為輕度鐵沉積，考慮原因可能為鐵過量導致家兔急性中毒死亡，因為文獻報道的劑量標準是依據(jù)沙鼠等嚙齒動物而定，鼠類的耐受力要強于家兔。整合文獻資料，在保證心肌鐵超負荷的造模目的，同時減少因為注射過多鐵劑導致的過高死亡率[25]。本實驗選擇新西蘭白兔作為實驗對象，通過白兔后頸背部皮下注射右旋糖酐鐵，按200 mg/kg體重注射右旋糖酐鐵，每周注射1次。在造模的過程中，發(fā)現(xiàn)注射鐵劑后的白兔進食量減少，活動減少，體重有所減輕。與注射鐵劑前體重相比，體重變化無統(tǒng)計學意義。研究顯示最好模擬人類鐵沉積機制的動物是沙鼠[25]。常規(guī)選擇嚙齒動物，因為這些都是常用的實驗動物。選擇家兔，主要考慮到對于一些需要手術(shù)、影像成像的研究，體型大的動物優(yōu)于小的。本次實驗通過鐵含量檢測、病理，從病理上可以證明家兔鐵顆粒首先沉積在心肌間質(zhì)，再進入細胞實質(zhì)，和人類相反。

3.3 白兔心肌鐵超負荷模型的病理改變

本研究通過每周給白兔皮下注射右旋糖酐鐵，成功建立了白兔心肌鐵超負荷模型。白兔注射右旋糖酐鐵1周后，病理切片顯示兔心肌未見鐵沉積(0級)。此時CIC達到0.295 mg/g，兔肝竇內(nèi)有大量鐵沉積，少部分肝細胞內(nèi)可見鐵沉積顆粒(0級)。白兔注射右旋糖酐鐵2周后，病理切片顯示心肌內(nèi)可見散在細小的鐵顆粒，分布范圍< 50%(I級)此時CIC達到0.70 mg/g。白兔注射右旋糖酐鐵16周后，病理切片顯示心肌內(nèi)可見較為彌漫的鐵顆粒沉積，分布范圍50% ～ 75%(II級)此時CIC達到1.24 mg/g，可見心肌細胞中的鐵染色顆粒增多與CIC增加呈正相關(guān)，提示在臨床中測CIC可反映心臟鐵沉積的病理變化。第2周開始幾乎所有肝竇及肝細胞內(nèi)見大量鐵顆粒，受累陽性細胞約100%(III級)。白兔鐵超負荷模型肝和心臟可見大量分布的鐵顆粒沉積，這和臨床鐵超負荷患者肝、心臟鐵顆粒沉積是一致的。

本研究結(jié)果顯示，CIC與LIC之間高度相關(guān)(r=0.712，P< 0.001)，提示隨著LIC的增加，鐵劑在心臟的沉積程度也隨著加重，認為在不能進行心臟活檢的情況，可以通過LIC在一定程度上預(yù)測預(yù)報心臟的鐵超負荷情況。CIC與SI之間中度相關(guān)(r=0.415，P=0.022)，提示隨著SI的增加，鐵元素在心臟的沉積程度也逐漸升高，認為在一定程度上SI可以預(yù)測心臟的鐵超負荷程度。CIC與注射鐵總量之間中度相關(guān)(r=0.698，P< 0.001)，認為CIC與LIC之間的相關(guān)性更高。

本實驗過程中，用雙蒸水反復清洗心臟、肝內(nèi)殘存血液，標本烘干后再送檢，測定標本的CIC和LIC，得到了標本干重的鐵濃度。由于沒有記錄新鮮心臟和肝的重量，因此在得到標本CIC和LIC后，無法計算心、肝的鐵攝取總量，不能得到注射鐵劑的器官攝取率。這是本研究的不足之處。

綜上所述，通過后頸背部皮下注射右旋糖酐鐵，可以成功建立心肌鐵超負荷兔模型，為鐵超負荷對心肌損害的發(fā)病機理及診斷、治療療效評估等研究提供模型。