邢敏，毛敬潔,2*，陳文列,2，李鉆芳,2

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122； 2. 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是癡呆的最主要病因，是老齡人口激增的社會(huì)背景下的世界性難題。AD的主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能缺陷，其典型病變包括由β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)異常沉積在神經(jīng)元細(xì)胞外形成的老年斑(senile plaque)和過度磷酸化tau蛋白異常沉積在神經(jīng)元胞內(nèi)形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle),以及中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的缺失、炎癥損傷和氧化應(yīng)激等改變[1]。毒性Aβ是淀粉前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)被β水解酶和γ水解酶異常裂解后形成的，γ水解酶的主要組分包含早老素蛋白(presenilin，PS)[2]。作為研究AD的常用動(dòng)物模型，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠可以表達(dá)人的淀粉前體蛋白和早老素蛋白，在出生后2月后腦組織中出現(xiàn)β淀粉樣蛋白病變和膠質(zhì)細(xì)胞增多，4 ～ 5月后出現(xiàn)老年斑、突觸退化、神經(jīng)元缺失和進(jìn)行性認(rèn)知功能減退[3-4]。

氫質(zhì)子磁共振波譜(proton magnetic resonance spectroscopy，1HMRS)是以結(jié)構(gòu)核磁成像(MR imaging，MRI)為基礎(chǔ)的、檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝物水平的方法[5]。作為一種無創(chuàng)性的檢查技術(shù)，1HMRS已被證實(shí)可用于AD的研究和輔助診斷，以評價(jià)其病變程度，預(yù)測其病程進(jìn)展，并可將其與路易體癡呆、額顳葉癡呆和血管性癡呆等鑒別診斷[6]，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型因較好地模擬AD病理特征和漸進(jìn)性病程，而被世界廣泛公認(rèn)[7]。但國內(nèi)外關(guān)于AD患者和動(dòng)物模型的1HMRS檢測報(bào)道較少，更缺乏對其各代謝物變化病因的深入探討。本實(shí)驗(yàn)通過分析APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠海馬區(qū)N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate， NAA)、肌醇(myo-Inositol，mI)、肌酸(creatine，Cr)、膽堿(choline，Cho)和谷氨酸(glutamate，Glu)等代謝物含量，結(jié)合對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，以及行為學(xué)的評價(jià)，企圖尋找APP/PS1小鼠腦組織中各代謝物與超微結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞層改變間的聯(lián)系，為能將APP/PS1動(dòng)物模型更好的應(yīng)用于AD疾病研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

12只SPF級雌性APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠[B6/JNju- Tg (APPswe, PSEN1dE9)/Nju]和12只同性別、同背景野生鼠(C57BL/6JNju)購于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所【SCXK(蘇)2015-0001】，10月齡，以普通成年鼠飼料、蒸餾水、12 h模擬晝夜光照循環(huán)、恒溫(22±2)℃、相對濕度為(55±5)%等條件于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(閩)2014-0001】適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 新物體識別實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)依據(jù)Bevins等[8]所描述的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前2日，小鼠先于50 cm × 50 cm × 25 cm的樹脂箱中每天適應(yīng)5 min，以排除環(huán)境因素的干擾。在訓(xùn)練階段，將兩個(gè)完全相同的圓柱狀紙盒(直徑5 cm，高10 cm)等距地放于裝置同一側(cè)，小鼠于對側(cè)中點(diǎn)背對紙盒面壁放入箱中，每只小鼠可以分別地自由探索5 min，探索時(shí)間以小鼠鼻在1 cm內(nèi)指向物體或接觸到物體的總時(shí)間為計(jì)。然后將小鼠放回籠中進(jìn)入 1 h的記憶階段。在測試階段，用一個(gè)新的方形物體(5 cm × 5 cm × 5 cm)取代其中的一個(gè)柱狀物，記錄小鼠5 min內(nèi)在裝置中探索新物體的時(shí)間、接觸物體的總時(shí)間和穿梭路徑。

1.2.21HMRS檢測

使用帶有23 mm的小鼠頭部表面線圈和12 cm的容積線圈的7.0T超高場磁共振成像儀(70/20USR BioSpec，Bruker，德國)掃描小鼠腦部，數(shù)據(jù)由Paravision 6.0.1和Bruker Topspin 3.1 PV (Bruker BioSpin, Bruker)采集。小鼠先用含3%異氟烷/30%氧氣的混合氣體呼吸誘導(dǎo)麻醉，再1.5%異氟烷/30%氧氣維持，將其以俯臥位固定于掃描床，以水熱循環(huán)系統(tǒng)(SC100,Thermo,美國)維持體溫于37℃左右，并用動(dòng)物生理檢測儀(SAM PC Monitor，Small Animal Instruments Incorporated，美國)實(shí)時(shí)監(jiān)測呼吸頻率。使用弛豫增強(qiáng)快速采集序列(rapid acquisition method with relaxation enhancement，RARE；TR=4200 ms，TE=35 ms，F(xiàn)OV=20 × 20 mm，35層，層厚0.5 mm)進(jìn)行T2加權(quán)掃描(T2-weighted images，T2WI)，以獲取軸位斷層后，選取1.5×1.5×1.5 mm3的右側(cè)海馬感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，經(jīng)勻場、抑水后，使用點(diǎn)分辨波譜脈沖序列(point-resolved water suppression pulse sequence，PRESS；TR=1500 ms，TE=20 ms，Scan time=6 min 24 s)掃描獲取波譜。各代謝物含量使用Topspin 5.0軟件分析，肌酸用作內(nèi)部參照物以計(jì)算其他代謝物的相對含量。NAA、mI、Cr、Cho和Glu的化學(xué)移位分別是2.02 ppm、3.56 ppm、3.02 ppm、3.22 ppm和2.2 ppm。

注：A：野生組軌跡圖。B：APP/PS1轉(zhuǎn)基因組軌跡圖。C：兩組小鼠新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與野生組比較，*P< 0.05。新物體識別指數(shù)=(接觸新物體時(shí)間/接觸物體總時(shí)間)×100%。圖1 兩組小鼠新物體識別實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note. A. Locus of wild type mice. B. Locus of APP/PS1 transgenic mice. C. Results of novel object recognition tests. Compared with wild group,*P< 0.05. Novel object recognition index=(Contacting time on new object/ total contacting time on objects) × 100%.Figure 1 Comparison of experimental results of novel object recognition results in two groups of mice (n=12, ± s)

1.2.3 透射電鏡技術(shù)

小鼠經(jīng)腹腔麻醉后，使用含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的PBS (pH 7.4, 4℃)心臟灌流。于冰上迅速剝離腦組織，將海馬切成約1×1×3 mm3的小塊。分別經(jīng)戊二醛和四氧化餓前、后固定，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂定向包埋，半薄切片定位后, 切90 nm超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察(H-7650, Hitachi,日本)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 新物體識別實(shí)驗(yàn)分析

如圖1所示， APP/PS1轉(zhuǎn)基因組總探索時(shí)間和新物體識別指數(shù)分別為41.7 ± 1.46和51.26 ± 3.67，野生組分別為39.55 ± 1.81和79.03 ± 1.71。APP/PS1轉(zhuǎn)基因組小鼠與野生組相比，總探索時(shí)間差異無顯著性(P> 0.05)，但新物體識別指數(shù)明顯下降(P< 0.05)，表明APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)記憶力減低。

2.2 代謝物1HMRS分析

APP/PS1轉(zhuǎn)基因組NAA/Cr、mI/Cr、Cho/Cr和Glu/Cr分別為1.73 ± 0.11、0.83 ± 0.06、1.22 ± 0.16和1.07 ± 0.15，野生組非別為1.91 ± 0.21、0.58 ± 0.08、1.11 ± 0.08和1.23 ± 0.17。與野生組相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因組NAA/Cr比值顯著減少(P< 0.05)，mI/Cr和Cho/Cr明顯增加(P< 0.05)，Glu/Cr比值雖有所下降，但差異無顯著性(P> 0.05，圖2)。

2.3 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

野生組小鼠腦細(xì)胞內(nèi)線粒體散在分布，次級溶酶體少量，突觸結(jié)構(gòu)完整(圖3A, C)。而與野生組相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生病理改變，胞質(zhì)內(nèi)線粒體大小不一，部分固縮，自噬溶酶體數(shù)量增多，其內(nèi)容物含脂滴樣成分；神經(jīng)元退變、數(shù)量減少；星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、腫脹，細(xì)胞基質(zhì)變淺，可見自噬泡以及營養(yǎng)障礙性突觸 (圖3B, D)。

注：A：野生組波譜。B：APP/PS1轉(zhuǎn)基因組波譜。C：兩組小鼠海馬區(qū)各代謝物相對Cr的含量變化。與野生組比較，*P< 0.05。圖2 兩組小鼠海馬區(qū)1HMRS檢測結(jié)果Note. A，1HMRS spectrum of wild type mice. B，1HMRS spectrum of APP/PS1 transgenic mice. C， Relative contents of each metabolite to Cr in hippocampus of two groups. Compared with wild group,*P< 0.05.Figure 2 Results of 1HMRS in hippocampus of mice in two groups (n=12, ± s)

注：A：野生組神經(jīng)元：線粒體散在分布，自噬溶酶體少量。B：APP/PS1轉(zhuǎn)基因組神經(jīng)元：線粒體固縮，含脂滴的自噬溶酶體數(shù)量增加。 C：野生組星形膠質(zhì)細(xì)胞：線粒體散在。D：APP/PS1轉(zhuǎn)基因組星形膠質(zhì)細(xì)胞：細(xì)胞腫脹、激活，吞噬營養(yǎng)障礙性突觸，線粒體變性、固縮，溶酶體增多。Nuc: 細(xì)胞核；Ly: 溶酶體；Mi: 線粒體；Sy: 突觸；Dn：營養(yǎng)障礙性突觸。圖3 兩組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(× 25 000，標(biāo)尺=1 μm)。Note. A, Neurons in the wild group: mitochondria scattered and a small number of autolysosomes. B, Neurons of APP/PS1 transgenic group: pyknotic mitochondria, increased number of autophagolysosomes containing lipid droplets. C， Astrocytes in the wild group: mitochondria scattered. D， Astrocytes of APP/PS1 transgenic group: cell swelling, activation, phagocytic dystrophic synapses, mitochondrial degeneration, pyknosis, and increased lysosomes. Nuc: nuclear, Ly: lysosomes, mit: mitochondrion, Sy: synapse, Dn: Dystrophic neurite.Figure 3 Ultrastructure of hippocampal cells in two groups of mice(×25 000, Bar=1 μm)

3 討論

AD的主要臨床表現(xiàn)為記憶力的減退。新物體識別實(shí)驗(yàn)利用小鼠相對于較熟悉的物體，更趨向于探索新的物體的習(xí)性，來測試小鼠的記憶和認(rèn)知能力[8]。在本次實(shí)驗(yàn)中， 10月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡同背景野生小鼠相比，記憶力明顯減退。

1HMRS是一種非侵入性的檢測方法，可以將不同化學(xué)環(huán)境中原子自旋產(chǎn)生的信號沿化學(xué)位移軸相互分離，形成由多個(gè)波峰組成的波譜，通過計(jì)算峰下面積，定量分析感興趣區(qū)(ROI)內(nèi)各代謝物的含量[9]。通常，AD患者和動(dòng)物模型中的Cr水平與正常對照相比差異不大，常用作內(nèi)參來比較其他代謝物的含量變化。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，10月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠海馬區(qū)NAA/Cr減少，mI/Cr和Cho/Cr增加。

NAA是神經(jīng)元線粒體中合成的一種氨基酸，存在于神經(jīng)元及其軸突內(nèi)，在神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝、天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)和滲透壓調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是神經(jīng)元活力和數(shù)量的標(biāo)志[10]。NAA水平低下，提示該腦區(qū)出現(xiàn)功能障礙，亦是區(qū)分正常老化和病理性癡呆的神經(jīng)元標(biāo)志物。Murray等的研究還證明在AD中，NAA/Cr比值的下降與突觸完整性被破壞和磷酸化Tau蛋白的增加有關(guān)[11]。神經(jīng)系統(tǒng)中，mI主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，在神經(jīng)退化過程中與組織中炎癥程度或星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化密切相關(guān)[12]。在AD中，活化的星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞多聚集在β淀粉樣斑塊的周圍，因此mI的多少與斑塊的數(shù)量成正比[13]。腦組織中的膽堿多為磷脂的組成成分，MRS中Cho峰代表了由磷脂酰膽堿裂解而成的甘油磷酰膽堿和磷酸膽堿，其為磷脂雙分子層的重要成分，因此Cho峰下面積的增加能夠反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞、炎癥反應(yīng)或細(xì)胞增殖[14]。膽堿是合成乙酰膽堿的前體之一，在AD中，Cho的增加很可能是為了彌補(bǔ)乙酰膽堿含量的不足[15]。

本實(shí)驗(yàn)將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與正常小鼠進(jìn)行對比后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體固縮，含脂滴的次級溶酶體數(shù)量增加；星形膠質(zhì)細(xì)胞腫大增生呈活化狀態(tài)，并吞噬營養(yǎng)障礙性突觸。Aβ的沉積誘發(fā)其周圍營養(yǎng)障礙性突觸的形成，而星形膠質(zhì)細(xì)胞通過包裹、吞噬病變突觸，清除突觸內(nèi)的畸變成分，但隨著疾病發(fā)展，沉積的加劇，這一病理改變促使了炎癥反應(yīng)的增加[16-17]。Aβ還可通過誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸，引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，破壞突觸的正常形態(tài)和功能[18]。由此推測，轉(zhuǎn)基因鼠海馬區(qū)細(xì)胞內(nèi)線粒體的病變，以及突觸結(jié)構(gòu)的異常、神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少，可能是引起NAA/Cr減少的病因；Aβ的增多及其誘發(fā)的異常炎癥反應(yīng)造成了mI/Cr比值的增加；而突觸膜結(jié)構(gòu)的破壞、含脂滴的溶酶體數(shù)量的增加和乙酰膽堿的不足，則很可能引起Cho/Cr的降低。

目前認(rèn)為在AD患者的1HMRS檢測中，NAA/Cr的減少和mI/Cr的增加是較為公認(rèn)的結(jié)果[19]，以往關(guān)于APP/PS1小鼠的1HMRS研究報(bào)道也多認(rèn)為NAA和mI有同樣的病理變化[20-22]，但由于檢測時(shí)小鼠月齡和ROI區(qū)域選擇的差異，Cho和Glu的檢測結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)并不完全相同。Chen等[20]對3、5、8月齡的轉(zhuǎn)基因鼠海馬區(qū)行1HMRS檢測，發(fā)現(xiàn)3月齡的轉(zhuǎn)基因鼠即出現(xiàn)mI/Cr的增加，5月齡時(shí)出現(xiàn)NAA/Cr的減少，并且這些變化隨著年齡的增加而加劇。Chaney等[21]對6、12、18月齡的轉(zhuǎn)基因鼠的海馬和背側(cè)丘腦進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，NAA和Glu明顯減少，Cho顯著增加。Liang等[22]對12月齡的轉(zhuǎn)基因鼠的海馬區(qū)檢測后發(fā)現(xiàn)NAA/Cr和Glu/Cr降低，mI/Cr上升。

本實(shí)驗(yàn)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的1HMRS檢測進(jìn)一步證明這一動(dòng)物模型可以有效模擬AD病變過程N(yùn)AA、mI和Cho等代謝物含量的改變，并通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)這些代謝物的變化可能與Aβ的增加引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、突觸結(jié)構(gòu)破壞、線粒體功能紊亂，以及溶酶體異常有關(guān)，為廣大AD研究者，更好地探討阿爾茨海默病的病理機(jī)制，提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物參考。