羅維，艾磊，周越

(1. 南京體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健康學(xué)院，南京 210014； 2. 北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理學(xué)教研室，北京 100084； 3. 江蘇省體育科學(xué)研究所，南京 210033)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)于分子生物學(xué)研究具有重要意義，目前最為常用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法主要包括電穿孔法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法和反轉(zhuǎn)錄病毒法[1-2]。陽(yáng)離子脂質(zhì)體法對(duì)細(xì)胞毒性較大，反轉(zhuǎn)錄病毒法又需要考慮多種安全因素[3]，而電穿孔法作為物理轉(zhuǎn)染方法，具有操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性好、轉(zhuǎn)染效率高、適用譜廣、作用機(jī)制清晰等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)于原代細(xì)胞等難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系具有較大的優(yōu)勢(shì)[4-5]。

RAW264.7細(xì)胞是小鼠來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞株[6-8]，近幾年因在代謝性疾病相關(guān)研究中受到廣泛關(guān)注而成為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的目標(biāo)細(xì)胞[9]。RAW264.7細(xì)胞體積較小，且易極化而難以擴(kuò)增和傳代，增加了該細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的難度[10-11]，目前未見(jiàn)穩(wěn)定高效的RAW264.7細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法。

Tribbles同源蛋白3(Tribbles Pseudokinase 3，TRIB3)是21世紀(jì)新發(fā)現(xiàn)的假激酶[12-13]，是目前尋找癌癥、心血管疾病、糖尿病等慢性代謝性疾病藥物靶點(diǎn)的研究熱點(diǎn)[14-15]，因此，本研究以電穿孔法在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和TRIB3 siRNA并檢測(cè)目的基因表達(dá)改變情況，以期望一方面建立穩(wěn)定的RAW264.7細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染條件，另一方面研究TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA的轉(zhuǎn)染條件，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TRIB3基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(Myc-DDK-Tagged，MR204806)、TRIB3 siRNA(SR410947)以及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒(PS100001)和對(duì)照siRNA均購(gòu)于美國(guó)OriGene公司。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)于自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要儀器

電穿孔儀器為日本BEX公司的CUY21EDITII型電轉(zhuǎn)染儀。電極杯購(gòu)于日本BEX公司，型號(hào)為SE-202，電極間隙尺寸為2 mm。電穿孔緩沖液為不含血清的培養(yǎng)基OPTI-MEM，購(gòu)于德國(guó)Gibco公司，貨號(hào)為31985-062。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與純化

本研究采用TRIB3基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(Myc-DDK-Tagged，MR204806)、TRIB3 siRNA(SR410947)以及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒(PS100001)和對(duì)照siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體為pCMV6-Entry Vector，全長(zhǎng)4929 bp，限制性內(nèi)切酶Sgf I (GCGAT▼CGC) 和Mlu I (A▼CGCGT)雙酶切目的基因與pCMV6-Entry Vector質(zhì)粒載體后, 使用T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物連接在一起，使得插入片段與載體定向匹配連接。質(zhì)粒純化采用陰離子交換樹(shù)脂柱純化方法，經(jīng)PowerPrep? HP Midiprep質(zhì)粒純化試劑盒進(jìn)行純化(NP100024)，試劑盒購(gòu)于美國(guó)OriGene公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行規(guī)范操作。TRIB3 siRNA為27-mer siRNA，其中TRIB siRNA(a)序列為rGrCrArUrCrUrGrArCrUrCrArArGrGrArArUrArGrUr CrUGG；TRIB siRNA(b)序列為rGrGrArArGrAr ArArCrCrGrUrUrGrGrArGrUrUrUrGrArUGA.

1.2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gibco，德國(guó))中，于5% CO2、37℃細(xì)胞孵育箱中孵育，依細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)1 ～ 2 d傳代一次。待細(xì)胞增殖傳代到足夠細(xì)胞量后統(tǒng)一凍存，選取同一代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.3 電穿孔轉(zhuǎn)染

RWA264.7細(xì)胞在電穿孔轉(zhuǎn)染前24 h換不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前吸出培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞刮下，離心后用OPTI-MEM重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106/24 μL OPTI-MEM，每次轉(zhuǎn)染時(shí)吸出24 μL細(xì)胞懸液，與一定量TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(2、4、6 μg)混合均勻，選擇110、120、130和140 mV電壓分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，單次脈沖時(shí)間分別為10、20和30 ms，重復(fù)次數(shù)為10次。

電穿孔轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞用不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基吹打混勻，接種于6孔板，倒置顯微鏡下觀察后置于5% CO2、37℃細(xì)胞孵育箱中孵育，24 h后更換含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基。每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

確定TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒最佳電轉(zhuǎn)條件后，再以這一電轉(zhuǎn)條件轉(zhuǎn)染10、20、50、100 nmol/L TRIB3 siRNA，進(jìn)行驗(yàn)證的同時(shí)篩選TRIB3siRNA的最佳轉(zhuǎn)染濃度。

1.2.4 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

電穿孔轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，收細(xì)胞時(shí)每孔加入10 μLCCK-8(美國(guó)APExBIO公司)，混勻，于孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度值(A450 nm)。根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞平均存活率：細(xì)胞存活率%=(A實(shí)驗(yàn)處理孔-A空白孔)/(A對(duì)照孔-A空白孔)×100，每個(gè)樣本重復(fù)三次，檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染條件對(duì)細(xì)胞存活率的影響。

1.2.5 TRIB3蛋白表達(dá)檢測(cè)

蛋白提取： 電穿孔轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞，將細(xì)胞刮下吸入2 mL EP管，4℃離心留沉淀，每管加入150 μL裂解液，混勻，置冰上裂解25 min；10 μL裂解的蛋白液加入蛋白定性液，分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度；剩余蛋白液加入等體積2 × loading bufer，100℃加熱10 min，4℃ 離心取上清。

Western Blot 蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)100 V電壓電泳和60 V電壓電轉(zhuǎn)后取出NC膜，立春紅預(yù)染剪下對(duì)應(yīng)條帶， TRIB3(美國(guó)abcam公司)以5%牛血清白蛋白封閉2 h，β-actin(北京中山金橋公司)以5%牛血清白蛋白封閉過(guò)夜。5%牛血清白蛋白配制一抗，TRIB3一抗?jié)舛葹?/2000、孵育過(guò)夜，β-actin一抗?jié)舛葹?/5000、孵育2 h。5%牛血清白蛋白配制二抗，TRIB3為兔源一抗，采用山羊抗兔二抗，濃度為1/500，β-actin為鼠源一抗，采用山羊抗鼠二抗，濃度為1/3000，均孵育2 h。X射線曝光膠片顯影。

顯影后的膠片掃描導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同脈沖電壓對(duì)細(xì)胞形態(tài)、存活率和目的基因表達(dá)的影響

BEX電穿孔轉(zhuǎn)染儀推薦的脈沖時(shí)長(zhǎng)為10 ～ 30 ms，脈沖電壓為100 ～ 150 mV，因此檢測(cè)不同脈沖電壓對(duì)RAW264.7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果時(shí)，質(zhì)粒濃度設(shè)為每樣本4 μg，脈沖時(shí)長(zhǎng)設(shè)為20 ms，脈沖電壓設(shè)為110、120、130和140 mV。轉(zhuǎn)染后24 h更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)110、120 mV組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無(wú)差異，細(xì)胞呈圓形或梭形貼壁生長(zhǎng)(圖1紅色箭頭標(biāo)示處)[16]，而130、140 mV組細(xì)胞換液前懸浮細(xì)胞較多，換液后細(xì)胞密度明顯減少且出現(xiàn)收縮變圓呈懸浮狀(圖1黃色箭頭標(biāo)示處)[17]，48 h后基本無(wú)貼壁細(xì)胞。110、120 mV組細(xì)胞存活率與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的對(duì)照組無(wú)差異(P< 0.05)，而130、140 mV組細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P< 0.01) (圖2)。

為了檢測(cè)目的基因表達(dá)變化情況，轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒72 h后進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞中TRIB3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，110 mV組TRIB3表達(dá)無(wú)顯著差異(P> 0.05)，130、140 mV組TRIB3表達(dá)顯著增加(P< 0.05)，120 mV組TRIB3表達(dá)增加更為顯著(P< 0.01) (圖3)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，110 mV脈沖電壓雖能保證較高的細(xì)胞存活率，但目的基因表達(dá)變化并不顯著；130、140 mV脈沖電壓雖能顯著改變目的基因表達(dá)水平，但細(xì)胞存活率較低；而120 mV脈沖電壓既能保證較高的細(xì)胞存活率，又能顯著促進(jìn)目的基因表達(dá)，是較為理想的RAW264.7細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染的電壓條件。

2.2 脈沖電壓恒定時(shí)不同脈沖時(shí)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、存活率和目的基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探索不同脈沖時(shí)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、存活率和目的基因表達(dá)的影響，結(jié)合2.1中結(jié)果，將脈沖電壓設(shè)為120 mV，質(zhì)粒濃度仍為每樣本4 μg，脈沖時(shí)長(zhǎng)設(shè)為10、20和30 ms。轉(zhuǎn)染后24 h更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)10、20 ms組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無(wú)差異，細(xì)胞呈圓形或梭形貼壁生長(zhǎng)(圖4紅色箭頭標(biāo)示處)，而30 ms組細(xì)胞換液前懸浮細(xì)胞較多，換液后細(xì)胞密度明顯減少且出現(xiàn)收縮變圓(圖4黃色箭頭標(biāo)示處)。10、20 ms組細(xì)胞存活率與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的對(duì)照組無(wú)差異(P> 0.05)，而30 ms組細(xì)胞存活率顯著低于對(duì)照組(P< 0.01) (圖5)。

為了檢測(cè)目的基因表達(dá)變化情況，轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒72 h后進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞中TRIB3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，10 ms組TRIB3表達(dá)無(wú)顯著差異(P> 0.05)，20、30 ms組TRIB3表達(dá)顯著增加(P< 0.01) (圖6)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，10 ms脈沖時(shí)長(zhǎng)雖能保證較高的細(xì)胞存活率，但目的基因表達(dá)變化并不顯著；30 ms脈沖時(shí)長(zhǎng)雖能顯著改變目的基因表達(dá)水平，但細(xì)胞存活率較低；而20 ms脈沖時(shí)長(zhǎng)既能保證較高的細(xì)胞存活率，又能顯著促進(jìn)目的基因表達(dá)，是較為理想的RAW264.7細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染的脈沖時(shí)長(zhǎng)條件。

2.3 電壓和電擊時(shí)長(zhǎng)恒定時(shí)不同質(zhì)粒濃度對(duì)細(xì)胞形態(tài)、存活率和目的基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探索不同質(zhì)粒濃度對(duì)細(xì)胞形態(tài)、存活率和目的基因表達(dá)的影響，結(jié)合2.1和2.2中結(jié)果，將脈沖電壓設(shè)為120 mV，脈沖時(shí)長(zhǎng)設(shè)為20 ms，質(zhì)粒濃度設(shè)為每樣本2、4和6 μg。轉(zhuǎn)染后24 h更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞形態(tài)均與對(duì)照組無(wú)差異，呈圓形或梭形貼壁生長(zhǎng)(圖7)。2、4 μg組細(xì)胞存活率與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的對(duì)照組無(wú)差異(P> 0.05)，而6 μg組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P< 0.05) (圖8)。

注：紅色箭頭標(biāo)注為貼壁生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞，黃色箭頭標(biāo)注為收縮變圓呈懸浮狀的RAW264.7細(xì)胞。圖4 不同脈沖時(shí)長(zhǎng)電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響(Bar=50 μm，×400)Note. The red arrows points RAW264.7 cells growing close to the wall, and the yellow arrows marks RAW264.7 cells which shrink and become round and suspend.Figure 4 Changes of morphology in RAW264.7 treated with gradient pulsed time(Bar=50 μm，×400)

注：與對(duì)照組相比，**P <0.01。圖5 不同脈沖時(shí)長(zhǎng)電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Note.**P <0.01 vs Control group.Figure 5 Effect of pulse time on RAW264.7 cell survival rate

為了檢測(cè)目的基因表達(dá)變化情況，轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒72 h后進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞中TRIB3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的對(duì)照組相比，2、6 μg組TRIB3表達(dá)無(wú)顯著差異(P> 0.05)，4 μg組TRIB3表達(dá)顯著增加(P< 0.01) (圖9)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，120 mV脈沖電壓、20 ms脈沖時(shí)長(zhǎng)是理想的巨噬細(xì)胞RAW264.7電穿孔轉(zhuǎn)染條件，但該條件下質(zhì)粒濃度也是影響轉(zhuǎn)染效果的重要因素，本研究中的TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒在4 μg 樣本濃度時(shí)能顯著增加目的基因表達(dá)水平。

2.4 電壓和電擊時(shí)長(zhǎng)恒定時(shí)不同TRIB3 siRNA濃度對(duì)細(xì)胞形態(tài)、存活率和目的基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證以上研究中的電穿孔轉(zhuǎn)染條件，本研究進(jìn)一步以該條件轉(zhuǎn)染不同濃度TRIB3 siRNA(TRIB3 siRNA(a)和TRIB3 siRNA (b))，根據(jù)質(zhì)粒說(shuō)明書(shū)，設(shè)置濃度為10、20、50和100 nmol/L。轉(zhuǎn)染后24 h更換培養(yǎng)基并觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞存活率，與2.3中結(jié)果一致，各組細(xì)胞形態(tài)均與對(duì)照組無(wú)差異，呈圓形或梭形貼壁生長(zhǎng)，且各組細(xì)胞存活率也與對(duì)照組無(wú)差異(P> 0.05)。

為了檢測(cè)目的基因表達(dá)變化情況，轉(zhuǎn)染TRIB3 siRNA 72 h后，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞中TRIB3蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TRIB3 siRNA組TRIB3表達(dá)均顯著低于對(duì)照siRNA組(P< 0.05)，但10、20 nmol/L TRIB3 siRNA(a)組和10 nmol/L TRIB3 siRNA(b)組的TRIB3表達(dá)顯著低于其他濃度組(P< 0.01) (圖10)。

注：與對(duì)照組相比，**P< 0.01。圖6 不同脈沖時(shí)長(zhǎng)電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)目的基因TRIB3蛋白表達(dá)的影響Note.**P< 0.01 vs Control group.Figure 6 Changes of TRIB3 protein expression in RAW264.7 treated with gradient pulsed time

圖7 不同質(zhì)粒濃度電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響(Bar=50 μm，×400)Figure 7 Changes of morphology in RAW264.7 treated with gradient plasmid concentration(Bar=50 μm，×400)

注：與對(duì)照組相比， *P <0.05。圖8 不同質(zhì)粒濃度電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Note.* P <0.05 vs Control group.Figure 8 Effect of plasmid concentration on RAW264.7 cell survival rate

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明120 mV脈沖電壓、20 ms脈沖時(shí)長(zhǎng)是巨噬細(xì)胞RAW264.7理想的電穿孔轉(zhuǎn)染條件，同時(shí)需要根據(jù)不同質(zhì)粒探索最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度以實(shí)現(xiàn)最好的轉(zhuǎn)染效果，本研究中的TRIB3 siRNA在10 nmol/L轉(zhuǎn)染濃度時(shí)能顯著抑制TRIB3蛋白表達(dá)。

3 討論

本研究以電穿孔法在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)設(shè)置不同的脈沖電壓、脈沖時(shí)長(zhǎng)和質(zhì)粒濃度探討電穿孔轉(zhuǎn)染對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率和目的基因表達(dá)水平的影響，篩選最優(yōu)電穿孔轉(zhuǎn)染條件后再次以TRIB3 siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染以進(jìn)一步對(duì)該轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行驗(yàn)證[18]，期望一方面建立穩(wěn)定的RAW264.7細(xì)胞電穿孔法轉(zhuǎn)染條件，另一方面研究TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，為后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

電穿孔轉(zhuǎn)染中脈沖電壓、脈沖時(shí)長(zhǎng)和質(zhì)粒濃度是影響細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)染效果的主要因素[19-20]。電阻一定的前提下，脈沖電壓大小決定了通過(guò)細(xì)胞及電轉(zhuǎn)液的電流大小，對(duì)于轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞存活率具有重要影響[21]，因此本研究首先檢測(cè)不同脈沖電壓對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率和目的基因表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明120 mV脈沖電壓既能保證較高的細(xì)胞存活率，又能顯著增加目的基因蛋白表達(dá)水平，是較為理想的RAW264.7細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染的電壓條件。

注：與對(duì)照組相比，**P< 0.01。圖9 不同質(zhì)粒濃度電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)目的基因TRIB3蛋白表達(dá)的影響Note.**P< 0.01 vs Control group.Figure 9 Changes of TRIB3 protein expression in RAW264.7 treated with gradient plasmid concentration

注：與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與對(duì)應(yīng)的10 nmol/L組相比，##P< 0.01。圖10 以最佳電轉(zhuǎn)條件轉(zhuǎn)染不同濃度TRIB3 siRNA對(duì)TRIB3蛋白表達(dá)的影響Note. *P< 0.05,**P< 0.01 vs Control group; ##P< 0.01 vs 10 nmol/L group.Figure 10 Changes of TRIB3 protein expression in RAW264.7 treated with TRIB3 siRNA

確定脈沖電壓條件后，本研究又進(jìn)一步檢測(cè)了電穿孔轉(zhuǎn)染中脈沖時(shí)長(zhǎng)和質(zhì)粒濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率和目的基因表達(dá)水平的影響[22]，發(fā)現(xiàn)脈沖時(shí)長(zhǎng)為20 ms，質(zhì)粒濃度為每樣本4 μg時(shí)，在保證較高的細(xì)胞存活率的同時(shí)，TRIB3蛋白表達(dá)水平約為對(duì)照組的1.8倍，顯著促進(jìn)目的基因蛋白表達(dá)。因此本研究認(rèn)為脈沖電壓120 mV、脈沖時(shí)長(zhǎng)20 ms、質(zhì)粒濃度每樣本4 μg是比較理想的RAW264.7細(xì)胞中電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染條件。

為進(jìn)一步驗(yàn)證這一脈沖電壓和脈沖時(shí)長(zhǎng)條件是否適用于在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA，本研究又以這一條件轉(zhuǎn)染TRIB3 siRNA，濃度為10 nmol/L時(shí)，細(xì)胞獲得較高存活率的情況下，TRIB3蛋白表達(dá)水平僅為對(duì)照組的0.19倍，顯著下調(diào)目的基因蛋白表達(dá)，說(shuō)明120 mV、20 ms的電穿孔條件同樣適用于在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TRIB3 siRNA。另外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)質(zhì)?；騭iRNA的轉(zhuǎn)染濃度與目的蛋白表達(dá)間均未成線性關(guān)系，我們分析可能是由于質(zhì)粒和siRNA濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響存在一定的閾值，過(guò)高或過(guò)低均有可能影響轉(zhuǎn)染效果。本研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)電穿孔轉(zhuǎn)染操作中應(yīng)密切關(guān)注電阻情況，一般在150 ～ 250 Ω之間較為合適，若電阻持續(xù)過(guò)低則應(yīng)減少細(xì)胞懸液體積或更換電極杯，若電阻過(guò)大則應(yīng)適當(dāng)增加細(xì)胞懸液體積。

綜上所述，本研究通過(guò)優(yōu)化脈沖電壓、脈沖時(shí)長(zhǎng)和質(zhì)粒濃度，以120 mV、20 ms條件在RAW264.7細(xì)胞中電穿孔轉(zhuǎn)染TRIB3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(每樣本4 μg)和TRIB3 siRNA(10 nmol/L)，在保證較高的細(xì)胞存活率的同時(shí)能顯著改變目的基因的蛋白表達(dá)水平，為后續(xù)RAW264.7細(xì)胞中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和借鑒。