彭婉君，趙彬彬，武婧，陳鑫，牛棟，劉江寧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，國家衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021)

手足口病(hand, foot and mouth disease，HFMD)自2008年在中國大陸大規(guī)模爆發(fā)以來，已成為一種經(jīng)常流行的病毒性傳染病，多發(fā)于嬰幼兒及5歲以下兒童。大部分患兒一周內(nèi)能痊愈，輕癥表現(xiàn)為手足口部位出現(xiàn)皰疹及斑丘疹；但也有少數(shù)患兒可迅速發(fā)展為嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如急性弛緩性麻痹、無菌性腦炎、腦脊髓炎、暴發(fā)性神經(jīng)性肺水腫等，病死率較高[1-2]?？滤_奇病毒A16型(Coxsachievirus A16，CA16)是手足口病的主要致病病原之一，與腸道病毒 71 型(Enterovirus 71，EV71)經(jīng)常交替或同時在中國大陸地區(qū)傳播，引發(fā)嚴峻的公共衛(wèi)生問題[3]。隨著EV71疫苗的面世，EV71的流行已得到一定的控制，而CA16的傳播仍是手足口防控的重點，研究其感染、致病機制和開發(fā)特異性疫苗、藥物是重中之重[4]。

CA16與EV71一樣，都屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirusgenus)人腸病毒A種(humanentereva，HEV-A)，是一種單鏈RNA病毒[5-6]。雖然CA16與EV71具有相似的形態(tài)和基因組構(gòu)成，但這兩種病毒引起的手足口病的臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制存在一定差異[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)了EV71和CA16共同的病毒受體類致病相關(guān)基因SCARB2[8-9]和PSGL-1[10]。近期有研究者發(fā)現(xiàn)CA16病毒可通過miR-1303靶向基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP)進而調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理改變[11]。其感染誘導(dǎo)的自噬也可通過抑制TLR7信號通路，阻礙I型干擾素的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致CA16在宿主細胞中成功復(fù)制[12]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)高表達可抑制CA16感染[13-14]。但迄今為止CA16病毒明確的致病機制仍尚未闡明，還需進一步研究。病毒作用機制的研究離不開合適的動物模型，目前CA16感染的動物模型主要為單一遺傳背景的小鼠、樹鼩、以及恒河猴等非人靈長類[15]。靈長類動物實驗成本過高，實驗周期較長，無法大規(guī)模應(yīng)用。小鼠體型小、繁殖快，是理想的實驗動物，但現(xiàn)有的CA16小鼠模型無法完全模擬人體自然感染病毒產(chǎn)生的臨床表現(xiàn)，且模型采用乳鼠，可用于感染研究的周期太短，其免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟，限制了該模型在研究CA16致病機理中的應(yīng)用。而遺傳多樣性小鼠資源(Genetic Diversity Mice，GD Mice)的出現(xiàn)，可部分彌補現(xiàn)有小鼠模型的缺陷。

為了模擬人群的基因多樣性、進行復(fù)雜性狀相關(guān)研究，復(fù)雜性狀聯(lián)盟(complex trait community，CTC)設(shè)計建立了遺傳多樣性小鼠資源庫，將其發(fā)展成為一種適用于研究復(fù)雜性狀或復(fù)雜病因疾病的研究工具。遺傳多樣性小鼠來源于8個親本品系，分別是A/J、C57BL/6J、NZO/H1LtJ、129S1Sv/ImJ、CAST/EiJ、NOD/ShiLtJ、PWK/PhJ和WSB/EiJ；目前經(jīng)過8個親本品系之間的雜交已獲得了數(shù)百種品系，每種品系都攜帶有8個原始親本的遺傳信息，覆蓋了90%的小鼠遺傳多樣性。由于遺傳多樣性小鼠具有清晰的遺傳背景、分散的遺傳位點和豐富的遺傳多樣性，可模擬多基因疾病，因此被應(yīng)用于傳染性疾病、腫瘤等人類復(fù)雜性疾病的人群易感性及預(yù)后研究，并取得突破性進展[16-18]。此外，利用GD小鼠的實驗設(shè)計簡單，實驗步驟簡便，與經(jīng)典的遺傳學(xué)分析比較，利用GD小鼠進行遺傳易感性分析具有明顯的優(yōu)勢[16]。本研究工作利用遺傳多樣性小鼠這一新型資源庫，從新的角度來篩選與CA16致病相關(guān)的基因，同時也獲得新的CA16感染的候選模型動物。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級4 ～ 6周齡的遺傳多樣性小鼠96只，雌雄各半， 23個品系，體重約為20 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所北方中心【SCXK(京)2014-0011】提供。SPF級4 ～ 6周齡C57BL/6小鼠6只，雌雄各半，體重約20 g，購于北京華阜康實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2014-0008】；本實驗得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用和管理委員會的批準(批準號：LJN18001)，于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物生物安全二級實驗室(ABSL-2)中進行實驗。實驗所用CA16病毒為Shzh05-1毒株(NCBI Accession number: 262658)，儲存病毒載量為108copies/mL。

1.1.2 主要試劑與儀器

低溫髙速離心機(BECKMAN，美國)，普通PCR儀(T100TMThermal Cycler， Bio-Rad，美國)；超低溫冰箱(三洋，日本)；Nano-Zoomer S60 熒光切片掃描儀(日本)；實時熒光定量PCR儀 QuantStudioTM3(ABI，美國)等。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific，美國)；Trizol 試劑(Life Technologies，美國)；10%福爾馬林中性固定液(索萊寶，中國)；實時熒光定量檢測染料(Takara，日本)。

1.2 方法

1.2.1 分組

實驗組：23個品系的遺傳多樣性小鼠(表1)；陰性對照組：C57BL/6J 小鼠(Negative Control，NC)；空白對照組：C57BL/6J 小鼠(Blank)。

1.2.2 動物感染

4 ～ 6周齡實驗組小鼠及陰性對照組以腹腔注射方式感染100 μL 108Copies/μL CA16 Shzh05-1毒株，空白對照組小鼠腹腔注射100 μL PBS。

1.2.3 樣本采集

感染3 d后，采用內(nèi)眥靜脈叢處取血方式獲得血液樣本，每只取樣約 100 μL，并置于 1 mL TRIzol 裂解液中，用于后續(xù)核酸提取和病毒載量的檢測；小鼠采用脫頸椎處死，之后取后肢骨骼肌，一份置于10%福爾馬林固定液中用于后續(xù)病理檢測；一份液氮速凍，用于核酸提取和病毒載量檢測。

1.2.4 血液和組織樣本的核酸提取以及病毒載量檢測

血液及肌肉組織采用TRIzol法提取RNA，之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，并采用染料法進行實時熒光定量PCR測定樣本中CA16病毒的核酸拷貝數(shù)。

1.2.5 組織病理檢測

將后肢骨骼肌于10%福爾馬林中固定72 h，經(jīng)梯度酒精脫水后將其包埋在石蠟中，切片得到的石蠟切片厚度為 5 μm，隨后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用 GraphPad Prism 6 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析；各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計學(xué)差異采用t-test 進行分析，P< 0.05 為差異具有顯著性。

2 實驗結(jié)果

2.1 CA16病毒在感染小鼠體內(nèi)擴增情況

本研究采用的Shzh05-1毒株在小鼠模型中臨床癥狀主要為肌肉損傷，為檢測病毒在感染小鼠體內(nèi)的復(fù)制擴增情況，在小鼠感染CA16病毒3 d后取血液及后肢骨骼肌組織，經(jīng)實時熒光定量PCR法測定其中的病毒載量。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，成年C57BL/6J小鼠對CA16病毒不易感，感染后可迅速清除體內(nèi)病毒，因此將其設(shè)置為陰性對照。對血液中病毒載量進行分析(圖1A)，發(fā)現(xiàn)品系DAVIS血液內(nèi)病毒載量最高可達108Copies/μL，對照組病毒載量僅有102Copies/μL。將與陰性對照組病毒拷貝數(shù)有顯著性差異的遺傳多樣性小鼠品系歸為易感品系，發(fā)現(xiàn)DAVIS、BOM、POH、FIM、YID這五個品系更為易感。由于實驗用毒株的嗜肌性，骨骼肌檢測到的病毒載量(圖1B)普遍高于血液，大多為105Copies/mg，品系FIM病毒載量最高可達108Copies/mg，陰性對照組為103Copies/mg。血液中病毒載量高的5個品系的骨骼肌病毒載量均高于104Copies/mg，與血液結(jié)果相匹配。而有2個品系雖然在血液中病毒載量呈較低水平，但在骨骼肌中病毒載量與對照組相比存在顯著性差異，也將其列為易感品系，為FEW、LAM(圖1C)。

綜上所述，不同品系的遺傳多樣性小鼠對CA16病毒感染的易感性存在明顯差異，分析共篩選出7個易感品系，分別為DAVIS、BOM、POH、FIM、YID、FEW和LAM。

2.2 CA16感染導(dǎo)致遺傳多樣性小鼠的組織病理變化

如圖2A易感品系FEW 所示，遺傳多樣性小鼠在CA16病毒感染3 d后，取后肢骨骼肌進行病理組織檢測，發(fā)現(xiàn)易感品系的小鼠后肢肌肉發(fā)生明顯病理損傷，主要表現(xiàn)為：局灶性細胞變性壞死，間質(zhì)水腫，炎癥細胞浸潤等。圖2B為不易感品系LOD小鼠肌肉病理表現(xiàn)，損傷較輕，僅有少數(shù)炎性細胞浸潤。圖2C為正常肌肉組織，來自空白對照組C57BL/6J。對比可知，易感品系小鼠病理癥狀較為嚴重，而不易感品系小鼠損傷較輕，這與病毒擴增數(shù)據(jù)相一致。

2.3 The Gene Mine 數(shù)據(jù)庫篩選CA16易感相關(guān)基因

The Gene Mine 數(shù)據(jù)庫可分析表型與基因型之間的關(guān)系，篩選表型相關(guān)基因，專用于遺傳多樣性小鼠研究[19-20]。以CA16感染的血液病毒載量數(shù)據(jù)為表型，篩選與之相關(guān)的基因位點。分析結(jié)果如圖3A所示，橫坐標為小鼠20對染色體，縱坐標LOD為P值對數(shù)值，LOD值越高，表明統(tǒng)計學(xué)差異越大，相關(guān)性越顯著。從圖可知，CA16感染致病相關(guān)基因主要分布于3號及4號染色體。進一步對3號及4號染色體進行分析，發(fā)現(xiàn)了三段核苷酸序列具有高LOD值(圖3B、C)，即CA16致病相關(guān)基因主要分布于這三段核苷酸序列。圖3D、3E則表明了這些基因與親本品系的相關(guān)性，相關(guān)性越高則數(shù)值越大。由圖可知3號染色體上的主效應(yīng)基因與親本W(wǎng)SB/EiJ相關(guān)性最低，與PWK/PhJ相關(guān)性最高； 4號染色體上的主效應(yīng)基因與與WSB/EiJ相關(guān)性最低親本，NZO/H1LtJ相關(guān)性最高。

與此同時，The Gene Mine數(shù)據(jù)庫給出了16個與CA16病毒感染相關(guān)基因(表2)。經(jīng)過生物學(xué)功能分類，發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)運相關(guān)基因5個，分別為Slc22a15、Casq2、Dennd2c、Syt6和Atp1a1，其功能主要與鈉鉀鈣離子轉(zhuǎn)運相關(guān)；細胞生長相關(guān)基因4個，分別為Sycp1、Bcas2、Ngf和Mab21l3；免疫相關(guān)基因2個，為白細胞分化抗原Cd2和黏附因子Igsf3，二者均為重要的免疫細胞表面功能分子，在機體對外界病毒感染進行免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用；轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因2個，為Csde1、Nr1h5；代謝相關(guān)基因2個，為Dpyd、Ampd1；癌癥相關(guān)基因tusc1。

綜上所述，利用The Gene Mine數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CA16致病相關(guān)主效應(yīng)基因集中于小鼠3號及4號染色體，并從中篩選出16個候選基因，為后續(xù)CA16致病機制研究提供基礎(chǔ)。

注：A：CA16易感基因在20對染色體中分布圖。B：3號染色體峰值放大圖。C：4號染色體峰值放大圖。D：3號染色體基因親本相關(guān)性圖。E：4號染色體基因親本相關(guān)性圖。圖3 The Gene Mine MugaQTL 遺傳分析圖Note. A, Distribution of CA16 susceptibility gene in 20 pairs of chromosomes. B, Peak magnification of chromosome 3. C, Peak magnification of chromosome 4. D, Parental correlation diagram of chromosome 3. E, Parental correlation diagram of chromosome 4.Figure 3 The Gene Mine MugaQTL genetic analysis map

表2 CA16感染致病相關(guān)基因列表Table 2 Genes related to CA16 pathogenicity

3 討論

柯薩奇A16病毒是手足口病的主要致病病原，與EV71病毒成為近年來我國手足口病流行的主導(dǎo)病毒[21]，其感染也可引起嚴重心肌炎、急性心力衰竭，甚至死亡[22]。傳染性疾病在人群中的臨床表現(xiàn)存在個體差異性，因此通過單一遺傳背景的小鼠已無法建立有效的動物模型復(fù)制人類疾病。遺傳多樣性小鼠以其更加豐富的性狀差異與遺傳多樣性，成為一種研究復(fù)雜性狀疾病的新型資源，是探究CA16致病相關(guān)基因的理想研究對象。

本研究共感染了23個品系的遺傳多樣性小鼠，不同品系對CA16病毒感染表現(xiàn)出不同易感性，從中我們篩選出7種易感品系，分別為DAVIS、BOM、POH、FIM、YID、FEW和LAM。易感品系小鼠感染病毒后病毒在體內(nèi)大量擴增，后肢骨骼肌表現(xiàn)出明顯病理損傷。在本實驗室前期發(fā)表文章中，不同品系遺傳多樣性小鼠對EV71病毒感染同樣存在不同易感性，易感品系與CA16比較發(fā)現(xiàn)存在5個重疊品系，分別為DAVIS、BOM、POH、FEW、LAM，其主效應(yīng)基因均與親本W(wǎng)SB/EiJ相關(guān)性最低[20]。之前研究發(fā)現(xiàn)CA16與EV71感染在體內(nèi)復(fù)制、病理損傷等方面極為相似，目前EV71與CA16共感染還未有疫苗或針對性藥物，該發(fā)現(xiàn)將會為手足口病病毒共感染模型建立提供前期基礎(chǔ)。

此外，通過The Gene Mine 數(shù)據(jù)庫分析，高效快速的篩選出16個CA16致病相關(guān)基因，分別為免疫相關(guān)類、代謝相關(guān)類、轉(zhuǎn)運相關(guān)類、細胞生長相關(guān)類、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)類和癌癥相關(guān)類。免疫反應(yīng)是機體抵御外界微生物入侵的主要道防線，免疫相關(guān)類基因也是本研究的關(guān)注重點。Cd2(CD2 antigen)是目前研究較為透徹T細胞表面抗原，主要由T細胞及自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)表達，可與LFA-3(CD58)和CD48結(jié)合使T細胞活化，在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮較為重要的作用[23-25]。Igsf3(immunoglobulin superfamily member 3)屬于免疫球蛋白超家族[26]。目前研究發(fā)現(xiàn)這種膜蛋白，可能具有黏附因子特性，為免疫細胞應(yīng)答提供活化或抑制信號，具體功能還需深入研究。除此之外，轉(zhuǎn)運相關(guān)類基因在候選基因中占較大比重，可通過建立基因敲除小鼠模型進一步深入研究該類基因在CA16感染中的作用。

綜上所述，本研究通過遺傳多樣性小鼠資源篩選出7個CA16感染易感品系，16個感染致病相關(guān)基因，為CA16病毒致病機制研究與新型動物模型的建立提供新的思路。其中Cd2與Igsf3基因可能與CA16感染密切相關(guān)，下一步將進一步驗證這些候選基因，通過建立基因敲除小鼠模型，進一步研究該基因在病毒感染中的具體功能與CA16病毒的致病機制。