邵芳冰，房軍帆，王思思，孫海櫸，項璇兒，方劍喬，杜俊英

(浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 針灸神經(jīng)生物學實驗室，浙江杭州 310053)

慢性疼痛的患者不僅有痛苦的軀體感覺，還常出現(xiàn)抑郁和焦慮等不良情緒反應，這種高共病率極大的影響人們的身心健康和生活質量，已引起現(xiàn)代社會的廣泛關注[1-2]。據(jù)流行病學研究報告顯示慢性疼痛患者中，高達54%的疼痛患者患有抑郁癥以及高達50%患者患有焦慮癥[3]，盡管這些疼痛相關癥狀經(jīng)常在人類中被觀察到，但迄今為止，研究慢性炎性痛和情緒障礙之間關系的動物研究十分有限且結果不統(tǒng)一[4-6]，抑郁和焦慮樣情緒和慢性疼痛之間的相互作用機制尚不清楚。

二十世紀以來，以動物疼痛行為測量為特征的實驗研究變得越來越普遍，通過動物行為，實驗動物可以對有害刺激做出直接的反應，并且通過行為表達自身的情緒感受，規(guī)避人為的主觀性，客觀可靠的得出實驗結論[7]。

本研究旨在通過目前神經(jīng)科學領域多種常用的動物行為檢測方法，動態(tài)的觀察弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)誘導的慢性炎性痛大鼠模型不同時間點機械縮足閾變化以及其誘發(fā)的痛情緒改變情況，為進一步進行痛情緒的機制及干預研究，提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級健康雄性SD 大鼠16只，體重(200 ± 20)g，購自中國科學院上海實驗動物中心【SCXK(滬)2018-0006】，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心飼養(yǎng)【SYXK(浙)2018-0012】。飼養(yǎng)期間大鼠給予嚙齒類動物標準顆粒飼料(由實驗動物中心提供)，每4只大鼠飼養(yǎng)一籠[室溫(23±2)℃，濕度40% ～ 60%]，籠底鋪滿無菌玉米芯顆粒墊料，自由進水，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，有良好的通風和空氣過濾系統(tǒng)，12 h:12 h晝夜循環(huán)光照。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.1.2 儀器與試劑

弗氏完全佐劑(CFA，Sigma 公司，美國)，Von Frey纖維絲(Thermo，美國)，高架O迷宮(瑞沃德，中國)，曠場(瑞沃德，中國)，Smart 3.0分析軟件(Panlab，美國)，蔗糖(源葉生物，中國)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模

分組：運用Spass軟件將大鼠完全隨機分為空白對照組(n=8)，模型對照組(n=8)。

造模：參考本課題組以往造模方法[8]，模型對照組于大鼠左側足底皮下注射CFA 0.1 mL，建立慢性炎性痛模型。空白對照組于相同部位注射等量無菌生理鹽水。

1.2.2 機械縮足閾(paw withdrawal thresholds，PWTs)

在安靜環(huán)境下，將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上透明有機玻璃箱內(20 cm × 20 cm × 15 cm)，自由探索并適應環(huán)境30 min，待大鼠安靜后，采用Chaplan 等[9]建立的Von-Frey纖維絲方法測量機械縮足閾，采用(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0 g)纖維絲套組，強度從4.0 g開始，用纖維絲依次刺激大鼠左后爪足底皮膚中央，避開足墊，用足夠的力量，對腳掌造成輕微屈曲，維持6 ～ 8 s。如果大鼠有明顯的縮足、甩足、抬足及舔足反應時，認為是陽性反應，就更換到相鄰小一號力量刺激絲；如果沒有反應，就更換到相鄰大一號力量刺激絲。記錄結果：出現(xiàn)明顯的躲避反應則記為“X”；若無反應則記為“O”，以出現(xiàn)第一對交叉符號作為起點，再連續(xù)測4次，得到一串以“O”或“X”組合的序列。用公式：機械縮足閾(g)=(10[Xf+κδ])/10000，計算并記錄。若連續(xù)5次刺激均為“O”則記為26.0 g，反之若刺激均為“X”則記為0.4 g。若計算得出PWTs > 26.0 g或 < 0.4 g，仍以26.0 g或0.4 g作為最大或最小值。

1.2.3 曠場實驗(open field test，OF)

曠場實驗參考溫存等[10]的實驗方法，保持實驗室較暗的光線，避免直射光線，恒定溫度[(23±2)℃左右]，保持環(huán)境安靜，測試前先將待測實驗大鼠放入實驗環(huán)境中30 min以適應環(huán)境。本實驗在100 cm × 100 cm × 50 cm的無蓋方箱中進行，用Smart 3.0軟件將曠場劃為16個格子，中間4格為中央?yún)^(qū)，其他12格為周圍區(qū)。開始時將實驗大鼠頭部背對實驗者輕緩放入曠場實驗箱中央?yún)^(qū)中，實驗人員遠離高架O迷宮，進行攝像。大鼠在曠場中先適應30 s，再記錄5 min的活動情況，分析實驗動物在曠場的中央?yún)^(qū)運動距離，中央?yún)^(qū)進入次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間和總運動距離。為消除動物氣味的嗅覺刺激，每次測量前均用10%的酒精清洗迷宮平臺，以消除上一次大鼠留下的信息(如氣味，大小便等)。

1.2.4 高架O迷宮實驗(elevated zero maze，EZM)

環(huán)境、適應條件及參考文獻同曠場。本實驗在直徑100 cm，高50 cm的圓形平臺上進行，圓形平臺由兩個開放臂和閉合臂組成。測試前先將待測實驗大鼠放入實驗環(huán)境中30 min以適應環(huán)境。開始時將實驗大鼠輕緩地放置于閉合臂和開放臂的交界，要求實驗大鼠頭面向開放臂，實驗人員遠離高架O迷宮，進行攝像。大鼠在O迷宮中先適應30 s，再記錄5 min的活動情況。用Smart 3.0軟件進行數(shù)據(jù)析，觀察并計算實驗大鼠高架O迷宮開放臂運動距離、開放臂進入次數(shù)、開放臂停留時間和總運動距離。為消除動物氣味的嗅覺刺激，每次測量前均用10%的酒精清洗迷宮平臺，以消除上一次大鼠留下的信息(如氣味，大小便等)。

1.2.5 新奇食物抑制實驗(novelty-suppressed feeding test，NSF)

新奇食物抑制實驗在Yalcin等[11]的實驗方法基礎上加以改進。實驗室需明亮，恒定溫度[(23 ± 2)℃左右]，環(huán)境安靜。實驗在40 cm × 40 cm × 30 cm黑色木箱中進行，箱底均勻覆蓋1 cm厚度的玉米芯墊料。在箱底中央白紙上放置一顆食物。實驗大鼠禁食不禁水24 h，測試之前先將待測實驗大鼠放入實驗環(huán)境中30 min以適應環(huán)境，實驗時從任意的箱角將大鼠放入箱內，通過攝像系統(tǒng)觀察5 min，記錄大鼠第1次啃食食物所用的時間即攝食潛伏期。在大鼠開始啃食食物后，立即將大鼠單獨轉移至籠子中，將稱重的食物放置5 min后，記錄預先稱重的食物的剩余重量，以排除食欲差異對進食時間的影響。若大鼠在5 min內未啃食食物，即記為5 min，隨后仍將大鼠單獨轉移至籠子中，進行食物消耗實驗。

1.2.6 大理石埋藏實驗(marble-burying test，MBT)

大理石埋藏實驗在許笑笑等人的實驗方法上稍作改進[12]，環(huán)境及適應條件同NSF。將大鼠單獨放入(40 cm × 25 cm × 20 cm)的籠子中，在籠中鋪上5 cm厚度的玉米芯墊料。籠內裝有9個直徑為2.5 cm的玻璃彈珠，以“3×3×3”形式排開。將大鼠單獨依次放入籠中，記錄大鼠10 min內掩埋玻璃彈珠顆數(shù)，其中玻璃彈珠2/3及以上體積被玉米芯墊料覆蓋，則認為大理石被掩埋。

1.2.7 糖水偏愛實驗(sucrose preference test，SPT)

糖水偏愛實驗在肖婷等人實驗方法上稍作修改[13]。實驗前，每只大鼠均單籠飼養(yǎng)，預適應2 d，預適應第1天兩瓶1%蔗糖水自由飲用，預適應第2天1%蔗糖水和純水自由飲用。實驗時，大鼠禁水24 h，然后將事先稱量好的等量1%蔗糖水和純水放入籠中，隔12 h后，調換糖水和純水的位置，以避免位置偏愛所造成的干擾，24 h后對糖水和純水進行稱重，記錄每只大鼠的液體攝入量。計算公式為：糖水偏好度(%)=糖水攝入量/(糖水攝入量+純水攝入量)×100%。

1.2.8 實驗設計

本研究通過在大鼠左側足底注射CFA建立慢性炎性痛模型，通過多時間點檢測PWTs改變情況；通過OF、EZM、NSF、MBT和SPT方法觀察其焦慮抑郁樣情緒行為變化，實驗安排詳見圖1。

圖1 實驗流程圖Figure 1 Experimental flow chart

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 慢性炎性痛模型大鼠不同時間點機械縮足閾改變情況

我們在造模前基礎(base)和造模后1，3，7，18和26 d，測量所有大鼠的PWTs。由圖2可見，兩組大鼠造模前基礎PWTs比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；造模后1 d，與空白對照組相比，模型對照組大鼠患側PWTs明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，提示CFA致炎性痛模型成功建立；造模后1，3，7，18和26 d，模型對照組大鼠患側PWTs均顯著低于空白對照組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。

2.2 慢性炎性痛模型大鼠曠場實驗結果

我們在造模后28 d進行曠場實驗，觀察慢性炎性痛模型大鼠的焦慮樣情緒。由圖3可見，與空白對照組相比，模型對照組大鼠中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)停留時間和中央?yún)^(qū)進入次數(shù)顯著減小，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)，結果表明模型對照組大鼠較空白對照組大鼠焦慮行為增加，出現(xiàn)焦慮樣情緒；兩組大鼠曠場內總距離比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，結果表明模型對照組大鼠未出現(xiàn)運動能力的改變。

注：與空白對照組相比，**P < 0.01。圖2 各組大鼠不同時間點機械縮足閾變化情況Note. Compared with the control group,**P < 0.01.Figure 2 Changes of paw withdrawal thresholds at different time points in each

2.3 慢性炎性痛模型大鼠高架O迷宮實驗結果

我們在造模后29 d進行高架O迷宮實驗，觀察慢性炎性痛模型大鼠的焦慮樣情緒。由圖4可見，與空白對照組相比，模型對照組大鼠開放臂運動距離、開放臂停留時間和開放臂進入次數(shù)顯著減小，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，結果表明模型對照組大鼠較空白對照組大鼠焦慮行為增加，出現(xiàn)焦慮樣情緒；兩組大鼠高架O迷宮內總距離比較，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，結果表明模型對照組大鼠未出現(xiàn)運動能力的改變。

2.4 慢性炎性痛模型大鼠新奇食物抑制實驗結果

我們在造模后30 d進行新奇食物抑制實驗，觀察慢性炎性痛模型大鼠的焦慮樣情緒。由圖5可見，與空白對照組相比，模型對照組大鼠攝食潛伏期顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，結果表明模型對照組大鼠較空白對照組大鼠焦慮行為增加，出現(xiàn)焦慮樣情緒；模型對照組大鼠與空白對照組大鼠5 min食物消耗實驗無統(tǒng)計學差異(P> 0.05)，表明兩組大鼠無食欲差異。

注：與空白對照組相比，**P < 0.01。圖3 各組大鼠曠場行為學變化情況Note. Compared with the control group,**P < 0.01.Figure 3 Behavioral changes of open field of rats in each group

注：與空白對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。圖4 各組大鼠高架O迷宮行為學變化情況Note. Compared with the control group, *P < 0.05, **P < 0.01.Figure 4 Behavioral changes of elevated zero maze of rats in each group

注：與空白對照組相比，*P < 0.05。圖5 各組大鼠新奇食物抑制實驗行為學變化情況Note. Compared with the control group,*P < 0.05.Figure 5 Behavioral changes of novelty-suppressed feeding test of rats in each group

2.5 慢性炎性痛模型大鼠大理石埋藏實驗結果

我們在造模后12，20和31 d進行大理石埋藏實驗，觀察慢性炎性痛模型大鼠的焦慮樣情緒。由圖6可見，與空白對照組相比，在模后12和20 d進行大理石埋藏實驗，模型對照組大鼠掩埋大理石顆數(shù)無明顯增加，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；模后31 d，模型對照組大鼠較空白對照組大鼠掩埋大理石顆數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；結果表明在模后31 d模型對照組大鼠較空白對照組大鼠焦慮行為增加，出現(xiàn)焦慮樣情緒。

注：與空白對照組相比，*P < 0.05。圖6 各組大鼠大理石埋藏實驗行為學變化情況Note. Compared with the control group,*P < 0.05.Figure 6 Behavioral changes of marble-burying test of rats in each group

2.6 慢性炎性痛模型大鼠糖水偏愛實驗結果

我們在模后17，25和35 d進行糖水偏愛實驗，觀察慢性炎性痛模型大鼠的抑郁樣情緒。由圖7可以可見，與空白對照組相比，在模后17，25和35 d模型組大鼠糖水偏愛度無明顯降低，差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。結果表明，模型對照組大鼠未出現(xiàn)抑郁樣情緒。

圖7 各組大鼠糖水偏愛實驗行為學變化情況Figure 7 Behavioral changes of sucrose preference test of rats in each group

3 討論

慢性疼痛的特點是持續(xù)的傷害性疼痛過敏，慢性疼痛患者多表現(xiàn)出焦慮、抑郁等不良的負性情緒，這些共病導致的后果遠遠超出了疼痛本身[14]。越來越多的學者已經(jīng)認識到痛相關情緒反應在疼痛中的重要性，對解開疼痛和不良情緒共病之間的關系充滿興趣。大量研究通過疼痛患者和嚙齒類動物疼痛模型的腦成像發(fā)現(xiàn)，大腦灰質體積、白質完整性甚至表觀遺傳變化都發(fā)生了變化[15]。目前共病的干預手段及機制研究正在迅速成為一大熱點，但動物不同于人類，無法用言語直接表達自身的感受，故行為學是最可觀且可靠表達情緒的檢測方法，故有著不可忽視的重要性。

慢性炎性痛是由持續(xù)性或未解決的炎癥引起的疼痛，CFA誘導的慢性炎性痛模型具有制備簡單、重復性強的優(yōu)點，是一種被國內外廣泛認可的慢性炎性痛模型。CFA注射后1 d，大鼠足跖出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，痛閾出現(xiàn)明顯的降低，這種持續(xù)的痛覺過敏可維持4 ～ 8周[16]。本實驗顯示在大鼠左側足底皮下注射0.1 mL CFA，模后1 d大鼠PWTs顯著降低，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，該結果與以往研究結果相一致[17]。由于神經(jīng)病理痛相較于慢性炎性痛可維持的痛覺過敏時間更長，研究痛情緒的時間跨度更廣，許多研究人員會偏愛神經(jīng)病理痛模型[18-19]，所以目前針對慢性炎性痛誘導的痛情緒研究相對十分有限并且存在結果不一致。

對于慢性炎性痛誘發(fā)的焦慮樣情緒， Yue等[20]的研究發(fā)現(xiàn)在C57BL/6小鼠右側足底注射10 μL CFA 7 d后，模型小鼠在曠場中央?yún)^(qū)停留時間和高架十字迷宮開放臂停留時間顯著降低，出現(xiàn)了焦慮樣情緒。Jiang等[21]在ChAT小鼠左側足底內注射50 μL的CFA，在模后28 d觀察模型小鼠中央?yún)^(qū)距離和時間減少以及進入開放臂的次數(shù)和時間減少。Pitzer等[22]人研究發(fā)現(xiàn)，在C57BL/6N小鼠右側足底注射20 μL CFA后14 d，雌性小鼠在開放臂停留時間減少，而雄性小鼠未發(fā)現(xiàn)該行為變化。另有研究對SD大鼠采用同樣的造模方法，發(fā)現(xiàn)模型大鼠在28 d和29 d時，在曠場中，中央?yún)^(qū)距離，進入中央?yún)^(qū)次數(shù)以及停留時間明顯減少，在高架O迷宮中進入開放臂次數(shù)和時間明顯減少，出現(xiàn)了焦慮樣情緒[23]。這些結果并不一致，而且往往很難比較，這些矛盾可能與動物的品系、性別、年齡、造模位置、藥物劑量以及生存環(huán)境均相關。本實驗在檢測大鼠焦慮樣情緒時選用OF、EZM、NSF、MBT這些經(jīng)典行為學范式，除MBT可重復多時間測試外，其余均只進行一次，以避免形成空間記憶，影響實驗結果。考慮到大多數(shù)報告陽性結果的研究是在誘導慢性疼痛至少四周后進行[24]，故只能觀察一次的行為學在本實驗中均從模后28 d開始進行。研究發(fā)現(xiàn)，在模后28 d，OF實驗中模型對照組大鼠中央?yún)^(qū)運動距離、中央?yún)^(qū)停留時間和中央?yún)^(qū)進入次數(shù)顯著減??；模后29 d，EZM實驗中模型對照組大鼠開放臂運動距離、開放臂停留時間、開放臂進入次數(shù)顯著減?。荒：?0 d，NSF實驗中模型大鼠攝食潛伏期顯著增加；模后31 d，MBT實驗中模型大鼠埋球數(shù)量顯著增加；這些結果均顯示慢性炎性痛大鼠出現(xiàn)了焦慮樣行為。而在模后12 d和20 d，MBT中模型大鼠較空白大鼠并未表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。結果表明，本實驗中CFA誘發(fā)的慢性炎性痛模型大鼠，在2 ～ 3周時并未表現(xiàn)出明顯的焦慮樣情緒，而在4周以后出現(xiàn)明顯的焦慮樣情緒。提示慢性炎性痛模型大鼠可能需要至少四周的時間才能誘發(fā)出與疼痛相關的不良情緒。

對于慢性疼痛誘發(fā)的抑郁樣情緒， Yalcin等[11]在神經(jīng)病理痛小鼠上進行系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)模后6 ～ 9周時模型大鼠出現(xiàn)抑郁樣情緒。而Grégoire等[25]通過單側跟骨關節(jié)內注射50 μL弗氏完全佐劑建立慢性炎性痛模型，發(fā)現(xiàn)在模后21 d模型大鼠糖精偏好度減少。故本實驗在慢性炎性痛模型大鼠模后17，25和35 d多時間點進行糖水偏愛實驗，發(fā)現(xiàn)相較于空白對照組大鼠，模型對照組大鼠糖水偏愛度并未出現(xiàn)明顯下降，該結果顯示5周的慢性炎性痛大鼠仍未能誘發(fā)出現(xiàn)抑郁樣情緒。對該不一致結果，我們猜測有以下幾種可能：(1)本研究中1%的糖水不及糖精甜度高，未能引出明顯的偏好差異。(2)本研究的造模方法引起的疼痛程度還不足以在5周時誘發(fā)抑郁樣情緒。

綜上，本實驗通過一系列多種經(jīng)典的行為學范式，研究發(fā)現(xiàn)CFA誘發(fā)的慢性炎性痛會引起大鼠情感功能的退化，產(chǎn)生一系列負性情緒，這些負性情緒會隨著時間的推移而出現(xiàn)，其情緒改變至少需要4周的觀察，且抑郁樣情緒可能比焦慮樣情緒更晚出現(xiàn)。同時本研究還為痛情緒的研究提供合適的動物模型，為痛情緒的進一步研究提供一定的參考價值。